重组贻贝粘蛋白的表征及功效评价

李敏 ， 魏文培 ， 乔莎 ， 郝东 ， 周浩 ， 赵硕文 ， 张立峰 ， 侯增淼

西安德诺海思医疗科技有限公司，西安 710000

贻贝粘蛋白（mussel adhesive protein， MAP）也称作贻贝足丝蛋白（mussel foot protein，Mfps），是海洋贝类——紫贻贝（Mytilus galloprovincalis）、厚壳贻贝（Mytilus coruscus）、翡翠贻贝（Perna viridis）等分泌的一种特殊的蛋白质，贻贝中含有多种贻贝粘蛋白，包括贻贝粘蛋白（Mfp 1～6）、前胶原蛋白（precollagens）和基质蛋白（matrix proteins）等［1］。其中，Mfp1～6 多数富含3，4-L-二羟基苯丙氨酸（dihydroxyphenylalanine，DOPA），也称多巴，是一种行使黏附功能的主体蛋白质。其中，Mfp1分子量约为110 kD，主要分布在贻贝足丝表面，在足丝纤维的胶原蛋白内核外层形成坚硬的保护层，增强了足丝纤维鞘的机械强度和耐性。Mfp2分子量约为45 kD，是斑块特有蛋白，同时也是斑块中最为丰富的蛋白质，半胱氨酸含量较高，主要依靠两端的多巴将其他蛋白分子连接起来，能够稳定整个粘附斑块的结构。Mfp3 在足丝斑块中分子量最小，约5.0～7.5 kD，多巴含量约为20 %（物质的量分数），仅次于Mfp5，主要分布在斑块与底物粘结的界面上。Mfp4 分子量约79 kD，富含精氨酸、组氨酸、甘氨酸和酪氨酸，位于远端足丝和粘附斑块的连接处，承担足丝向斑块的形态学和力学转化。Mfp5的分子量为11 kD，含有30%（物质的量分数）的多巴，是目前发现的多巴含量最高的足丝蛋白，主要分布在足丝斑块与基质的接触面，被认为是贻贝与外界固体表面起粘附作用的主要蛋白质。Mfp6分子量约11.6 kD，酪氨酸含量很高，与Mfp3、Mfp5 共同位于粘附斑块的界面处，为Mfp3、Mfp5 中的多巴提供还原环境。而前胶原蛋白以及基质蛋白则多数富含甘氨酸和脯氨酸，主要负责足丝内部的分子交联［1-2］。虽然这些足丝蛋白分子量跨度很大，但在理化性质上具有一定相似性，并且成熟的足丝蛋白大都含有大量的多巴。多巴对足丝蛋白的粘附功能至关重要，多巴转换为多巴醌并通过氢键与外界基质形成牢固的连接以行使粘附功能［3-6］。贻贝分泌的这一类足丝蛋白会因海洋中盐度、湿度、pH 的变化，使贻贝对不同类型的表面发生粘附以及脱粘附作用。受贻贝足丝蛋白粘附特性的启发，目前部分贻贝足丝蛋白已被应用于医用粘合剂、创面修复等医药领域。

目前，获取贻贝粘蛋白最直接的方法就是从贻贝足腺中直接提取天然粘附蛋白成分，但由于贻贝足丝蛋白的分泌量很低，1 万个贻贝仅能提取约1 mg 粘附蛋白，这种直接提取的粘合剂产品价格昂贵且容易固化，因此制约了其应用范围。基因工程手段是目前获得贻贝粘蛋白的另一有效途径，但是获得的贻贝粘蛋白也存在表达量低和粘附性能不如意的状况。如何获得纯度高、生物安全性好且具备良好粘附性能的贻贝粘蛋白是未来重要的研究方向。

Hwang 等［7］构建了重组杂交贻贝生物胶fp-151，该蛋白将来源于紫贻贝的足丝蛋白Mfp1 和Mfp5 进行融合，在大肠杆菌中表达。该蛋白共196 个氨基酸，其中，第1～60 位氨基酸为6 个Mfp1 序列的重复串联，第61～136 位氨基酸为1个Mfp5 序列，第137～196 位氨基酸为6 个Mfp1序列的重复串联。fp-151 解决了Mfp5 可溶表达抑制细胞生长以及其纯化后在缓冲液中高度不溶的问题，fp-151 在大肠包涵体中产生，不抑制细胞的生长，同时也保留了贻贝的强粘附功能，纯化后的溶解度也显著增强，但未对其功效作用进行进一步评价。本研究对重组贻贝粘蛋白MFP151 进行了结构表征，并在促进细胞迁移、修复愈合方面的功效进行了初步评价及原理分析，以期为贻贝粘蛋白的进一步应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

凝胶图像分析系统（BG-gdsAUTO520，百晶）；电泳仪及电源（北京六一仪器厂）；电热鼓风干燥箱（WGL-65B，天津市泰斯特仪器有限公司）；紫外可见分光光度计（UV1800，岛津）；细胞培养箱（BPN-150CRH，上海一恒）；倒置显微镜（IX73，奥林巴斯）；离心机（TGL-16，湘仪）；酶标仪（TECAN Infinite F50）。

1.2 主要材料

重组贻贝粘蛋白（型号：MFP151，本公司发酵生产，批号：2010C01）：共196个氨基酸残基组成。其中，第1～60 位氨基酸为Mfp1 贻贝粘蛋白特征十肽（AKPSYPPTYK）6 重复串联，第61～136 位氨基酸为Mfp5 贻贝粘蛋白序列，第137～196 位氨基酸为Mfp1贻贝粘蛋白特征十肽（AKPSYPPTYK）6重复串联［7］。鲎试剂购自博康海洋生物有限公司（批号：1907082，灵敏度λ为0.25 EU·mL-1）。左旋多巴标准品（B2217189，阿拉丁）。实验中所用DEME 高糖完全培养基、PBS 磷酸盐缓冲液（pH 7.2～7.4）均由武汉普诺赛生命科技有限公司提供。

1.3 表征

1.3.1N 端测序 采用Edman 降解法测试，由上海中科新生命生物科技有限公司完成。

重组贻贝粘蛋白经SDS-PAGE 电泳（10%预制胶，Invitrogen 垂直电泳仪）分离目的条带，通过半干法转印至PVDF 膜上，用丽春红染液染色，用纯化水漂洗至条带清晰，根据Marker 相对分子量确定目的条带，将目的条带剪下后放置到反应器中，通过PPSQ 全自动蛋白多肽测序仪（SHIMADZU）进行15个循环测试。

1.3.2分子量测定 通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（5800 MALDI-TOF/TOF）对重组贻贝粘蛋白相对分子量进行分析，由上海中科新生命生物科技有限公司完成。

1.3.3氨基酸组成分析 使用6 mol·L-1盐酸将重组贻贝粘蛋白样品酸水解为游离氨基酸，用异硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PITC）法对游离氨基酸进行衍生化处理之后，使用高效液相色谱对衍生化的氨基酸样品进行分析，根据外标法计算确定样品中氨基酸组成的摩尔百分比，由上海中科新生命生物科技有限公司完成。

1.3.4纯度（电泳法）分析 纯度测定按照SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行。将重组贻贝粘蛋白配制成蛋白含量为1 mg·mL-1的溶液，同时配制0.01 mg·mL-1重组贻贝粘蛋白作为灵敏度对照溶液。分别与4×非还原型蛋白上样缓冲液（三羟甲基氨基甲烷3.03 g，溴酚蓝0.020 g，十二烷基硫酸钠8.0 g，甘油40 mL，加水溶解并稀释至约80 mL，用盐酸调节pH至6.8，加水定容至100 mL）以3∶1的比例混合后，煮沸5 min，室温冷却后2 000 r·min-1离心20 s。采用5%浓缩胶、15%分离胶恒压模式电泳，初始电压80 V，进入分离胶后调至120 V，直至电泳结束。电泳结束后以考马斯亮蓝R250进行染色，脱色至背景透明，使用Gel-Pro Analyzer 4.0进行纯度分析。

1.3.5内毒素测定 按照细菌内毒素检查法测定内毒素含量［8］，每l mg 样品中内毒素的量应小于10 EU。

称取0.050 g 重组贻贝粘蛋白于无热源试管中，加入10 mL细菌内毒素检查用水配置成浓度为5 mg·mL-1的溶液，同时配制对照溶液：①2λ/检查用水（λ为鲎试剂的标示灵敏度，单位为EU·mL-1）：取细菌内毒素工作标准品1 支，用内毒素检查用水溶解并稀释致含内毒素为2λ 的标准品溶液。②2λ/供试品溶液：用10 mL 2λ/检查用水溶液溶解重组贻贝粘蛋白0.05 g配制即得。③无内毒素/检查用水。所有样品均配制2管，进行内毒素测定。

1.3.6多巴含量测定 多巴含量测定按照YY/T 1293.6-2020中多巴含量试验进行［9］。

多巴标准曲线制备：左旋多巴标准品20 mg，用0.012 mol·L-1盐酸溶解定容到100 mL，分别取0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于10 mL容量瓶中，用0.012 mol·L-1盐酸稀释定容至刻度，摇匀即得多巴浓度为：0、2、10、20、30、40、50、60 μg·mL-1系列标准溶液。

称取0.025 g重组贻贝粘蛋白，用0.012 mol·L-1盐酸溶解定容到50 mL，即得浓度为0.5 mg·mL-1重组贻贝粘蛋白溶液。

分别取系列标准溶液和重组贻贝粘蛋白溶液各1 mL 置于试管中，向每支试管中加入0.5 mL 0.516 mol·L-1盐酸，然后每管中依次加入1.5 mL亚硝酸试剂；5 min 后加入2 mL 1 mol·L-1氢氧化钠摇匀，在500 nm 波长下测定吸光度。用Origin 9.0 软件进行数据分析，以多巴浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标制作标准曲线，再根据测得的样品溶液的吸光度值计算出样品的多巴含量W。

式中，W为供试品中多巴的百分含量；Ci为标准曲线中计算出的样品测定液中多巴浓度，单位为μg·mL-1；M为重组贻贝粘蛋白称样量，单位为mg。

1.4 功效评价

1.4.1细胞迁移 采用细胞划痕实验来评价重组贻贝粘蛋白对人包皮成纤维细胞HFF-1（CL-0352，武汉普诺赛生命科技有限公司）细胞迁移率的影响。①铺板：将2×106个细胞数接入6 孔板中，培养24 h（可调节）后用枪头划线，加入PBS缓冲液清洗细胞3 次。②随后加入含不同浓度梯度的贻贝粘蛋白DEME 培养基培养，分别为50、60、200、500、900 μg·mL-1，同时设置DEME 培养基为空白对照。培养0、6、20、28 h 在显微镜下拍照。用Image J 分析细胞划痕面积，并按照式（2）计算细胞迁移速率。用GraphPad Prism 8.0 软件采用双向方差分析模型（双因素ANOVA）进行数据分析，绘制细胞迁移速率和时间柱状图。其中细胞迁移速率越大，该浓度重组贻贝粘蛋白促进细胞增殖的作用越明显。

1.4.2修复功效 本检测由杭州环特生物科技有限公司完成，通过手术刀沿与躯干垂直方向切断斑马鱼尾鳍，以再生的尾鳍面积定量结果来评价样品的组织修复功效，用Image J进行尾鳍面积分析，用GraphPad Prism 8软件进行独立样本t检验分析。

2 结果与分析

2.1 N端测序

蛋白质的生物合成起始于N 端，该区域是蛋白质重要的结构和功能部位，序列特异性高，通过N 端的少数几个氨基酸残基可以对大多数蛋白质进行鉴定，因此对于重组蛋白N 端序列的分析是鉴定重组蛋白表达的最直接方式。测序结果显示重组贻贝粘蛋白N 端序列为：NH2-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Pro-Pro-Thr-Tyr-Lys-Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr，与设计预期的序列完全一致。

2.2 分子量测定

蛋白质的相对分子质量是鉴别蛋白质的重要特征参数，是确定一种新型蛋白及进行蛋白质后续研究活动的重要前提。图1 为重组贻贝粘蛋白MFP151 的MALDI-TOF-MS图，图中横坐标为离子的质荷比（m/z），纵坐标为离子相对丰度，重组贻贝粘蛋白MFP151 的理论分子量是22.61 kD，实测分子量为22.911 kD，图2 中m/z 22 911.8 峰为MFP151 质子化分子离子峰，即［M+H］+峰，m/z 45 858.4 峰为MFP151的二聚体峰［2M+H］+。实测分子量较理论分子量偏大，推测为酪氨酸酶将酪氨酸残基修饰为多巴从而使分子量变大，符合预期。

图1 MFP151分子量测定Fig. 1 Molecular weight determination of MFP151

2.3 氨基酸组成分析

蛋白质多肽链中氨基酸的组成分析是研究蛋白质分子高级结构和功能的基础，结果如表1所示，实测样品氨基酸个数与摩尔数基本与理论序列一致。

表1 MFP151氨基酸组成Table 1 Amino acid composition of MFP151

2.4 纯度检测结果

蛋白质纯度是重组蛋白制品的一项重要检测指标，不仅能评价分离工艺的有效性，还对制品的质量属性起到重要的监测作用。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图2所示，表2为电泳结果进行光密度分析后得到的重组贻贝粘蛋白纯度，达96%以上。

表2 MFP151纯度分析结果Table 2 Purity analysis results of MFP151

2.5 内毒素含量测定

细菌内毒素试验主要用于检测样品是否含有引起机体发热的内毒素，是评价生物材料生物安全性的指标之一。内毒素是由细菌死亡裂解或自溶引起的，极微量的细菌内毒素进入动物或人体内都会引发强烈的炎症反应，因此细菌内毒素是需要在生产阶段控制的一项安全指标，本研究中采用凝胶法对重组贻贝粘蛋白内毒素进行检测，结果如表3 所示，重组贻贝粘蛋白内毒素小于10 EU·mg-1，符合T/CASME 530—2023 标准中对内毒素含量的要求［8］。

表3 内毒素检测结果Table 3 Endotoxin test results

2.6 多巴含量

多巴是贻贝粘附的关键，贻贝粘蛋白中的多巴及其氧化物极大地促进了粘附蛋白的附着能力，这些附着能力主要由多巴侧链中的邻苯二酚提供［11］。文中采用改良的Arnow 方法对重组贻贝粘蛋白中多巴的含量进行测定，绘制的标准曲线如图3，标准曲线回归方程为y=0.010 15x-0.006 2，相关系数R2=0.996 27。多巴含量测定结果如表4所示，平均为5.81%±1.07%，大于5%。

表4 多巴含量测定结果Table 4 Determination results of DOPA content

图3 多巴含量测定标准曲线Fig. 3 Standard curve of DOPA content determination

2.7 功效评价

2.7.1细胞迁移 本实验通过细胞划痕实验考察不同浓度的重组贻贝粘蛋白对人包皮成纤维细胞迁移作用的影响。由图4～5可知MFP151高浓度组900、500 μg·mL-1均抑制人包皮成纤维细胞增长，其中900 μg·mL-1的抑制效果大于500 μg·mL-1，并在20～28 h内具有显著性（P＜0.05）；低浓度组（50、60、200 μg·mL-1）在6～28 h 均具有促进细胞迁移的作用，浓度为60 μg·mL-1时促进增殖的作用最明显，且具有极显著性差异（P＜0.01）。贻贝粘蛋白通过静电相互作用对细胞的贴壁和粘附产生影响［12］，在高浓度条件下，对细胞的静电作用力增强，粘附性能增强，减缓了细胞迁移的速率；当浓度较低时，这种静电吸附作用力的吸引会促进细胞的快速爬行和增殖，因此出现了高浓度抑制细胞迁移、低浓度促进细胞迁移的现象。

图5 不同浓度MFP151对细胞迁移速率的影响Fig. 5 Effects of MFP151 at different concentrations on cell migration rate

2.7.2修复功效 斑马鱼尾鳍的再生与人类皮肤、骨骼、血管等修复作用机制相似，通过手术沿躯干垂直方向切断尾鳍，以斑马鱼尾鳍的再生面积定量结果可评价重组贻贝粘蛋白的组织修复功效。由表5 可知，重组贻贝粘蛋白组斑马鱼尾鳍面积与模型对照组相比极显著增加（P＜0.001），图6 为斑马鱼尾鳍修复果对比图，重组贻贝粘蛋白组尾鳍明显比模型对照组尾鳍面积增大，说明重组贻贝粘蛋白具有修复功效。

表5 斑马鱼修复功效分析结果Table 5 Statistical analysis results of repair efficacy

图6 斑马鱼尾鳍修复效果Fig. 6 Repair effects of tail fin of zebrafish

3 讨论

本文中所述的重组贻贝粘蛋白采用MFP1 和MFP5 融合，其氨基酸序列组成如前所述，对获得的重组贻贝粘蛋白关键质量指标表征，如蛋白一级结构相关指标、蛋白纯度、内毒素含量、多巴含量，结果均满足医用要求；同时从细胞水平和动物水平进行功能评测，显示出重组贻贝粘蛋白具有促进创面修复和愈合的作用。分析上述原因，可能与氨基酸组成有关。首先，MFP151 的196 个氨基酸序列中有40 个赖氨酸，占整个氨基酸序列的20.4%，赖氨酸为碱性氨基酸，当pH 低于等电点时赖氨酸使蛋白带有高载量正电荷，表皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞等均带负电荷，因此，MFP151可以通过静电相互作用与细胞紧密、快速结合，促进细胞的贴壁、爬行替代，从而加速创面的愈合［12-14］。其次，MFP151 中含有的丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸等均为疏水氨基酸，占整个氨基酸序列的34.7%，可与细胞膜的脂质双分子层通过疏水作用相互结合，强化细胞的隔水黏附和局部稳定性［15］。再次，MFP151 中多巴含量达5%以上，多巴具有独特的儿茶酚功能单元，儿茶酚基团由于羟基的吸电子效应，具有很强的金属螯合能力，在材料表面可以形成稳定的有机金属络合物，还可以与蛋白质等极性聚合物形成很强的氢键结合，并快速粘附到细胞或创口表面固化形成一层透气、防水、有弹性的膜，该薄膜可使创口或手术切口免受水、细菌、微生物等侵害［16-17］。

贻贝粘蛋白具有良好的生物相容性和多功能性。天然提取的贻贝粘蛋白目前已在临床中得到应用，如江阴贝瑞森公司研究开发的Ⅱ类医疗器械产品贻贝粘蛋白创面修复敷料［18］、贻贝粘蛋白肛肠敷料［19］等，同时重组贻贝粘蛋白在医学美容领域也开始崭露头角，如湖南科妍创美医疗公司研究开发的重组贻贝粘蛋白水凝胶敷料、湖南美研再生医学公司的贻贝粘蛋白修护液均采用重组贻贝粘蛋白为原料。分析上述产品，其临床适应症主要针对皮肤创面或黏膜的护理、修复。

贻贝粘蛋白还具有止痒、抗氧化和抗炎作用，虞俊杰等［20］发现贻贝粘蛋白对于治疗烧伤后的瘙痒有效。丛林等［21-22］发现贻贝粘蛋白对面部敏感性皮肤临床症状有改善作用，对瘙痒症状有非常好的缓解作用。刘朝阳等［23］通过对大鼠溃疡性结肠炎的研究证明了贻贝粘蛋白组炎症细胞浸润程度较模型组明显减轻，具有良好的抗炎作用。

综上所述，贻贝粘蛋白在医药、医疗器械、化妆品领域具有巨大的应用潜力，但因天然的贻贝粘蛋白提取量低，导致其价格昂贵。虽然学者们已经开展了基因工程手段生产贻贝粘蛋白，但由于基因工程技术所得到的贻贝粘蛋白缺少在贻贝体内严格而充分的修饰和加工过程，导致基因工程手段所得到的蛋白产物黏度弱于天然蛋白，这限制了重组贻贝粘蛋白的应用。因此，开发面向应用的蛋白质材料精准装配与后加工技术，获得良好生物相容性与生物功效性的重组贻贝粘蛋白产品及衍生产品是未来需要重点关注的方向。