真菌Stilbella sp. CGMCC 40422的萜类产物研究

宋开南 ， 艾羽桐 ， 徐玉泉

中国农业科学院生物技术研究所， 北京 100081

萜类化合物是由多个异戊二烯单元构成的烃类含氧衍生物，在自然界中分布广泛，是天然产物中占比最高的一类次级代谢产物。萜类化合物因其复杂的骨架结构与优良的药理、生理活性，在食品、化工、医药和能源等领域应用广泛，常见的萜类化合物有倍半萜青蒿素、二萜银杏内酯和三萜甘草次酸等［1-2］。

目前，萜类化合物的获取方式主要有植物提取法、化学合成法与细胞工厂合成法。传统的植物提取法具有产物含量低、分离纯化难度大、植物种植周期长等局限性；化学合成法也存在着能耗高、效率低、环境不友好等缺点；细胞工厂合成法则具有周期短、成本低、环境友好等优势［3-4］。近年来，科学家们利用微生物细胞工厂高效合成萜类化合物取得了突破性进展。如李春等［5］在酿酒酵母中过表达MVA 途径限速酶，偶联半乳糖代谢调控网络，并经过发酵调控优化，使得五环三萜齐墩果酸的产量达到606.9 mg·L-1。张学礼等［6］从山楂中鉴定出细胞色素P450酶CYP716C49，利用工程化酿酒酵母对其异源表达，合成了熊果酸和科罗索酸，其中科罗索酸的产量达到141 mg·L-1。然而，利用微生物细胞工厂合成萜类化合物的产量仍不能满足市场日益增长的需求［7］，并且常用的底盘细胞酿酒酵母并不能准确地识别其他真核生物基因的内含子和外显子，P450 酶在酿酒酵母中的功能性表达难度很大，故而寻找新的底盘细胞势在必行［8］。

本研究从土壤中分离得到一株高产萜类化合物的丝状直菌Stilbellasp. CGMCC 40422，通过核磁共振与高效液相色谱等方法对萜类产物的结构与产量进行研究，以期为进一步开发萜类化合物生产的底盘细胞奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1仪器 Agilent 核磁共振波谱仪（600 MHz DD2 型）；Agilent 液相色谱-质谱联用仪（1290 ⅡUHPLC，G6125B单四极质谱）；Agilent制备型高效液相色谱仪（1260 Ⅱ型）；Agilent 半制备Eclipse XDB-C18 反相柱（9.4 mm×250 mm，5 μm）；BUCHI旋转蒸发仪（R-300 型）；TOMY 高压蒸汽灭菌锅（SX-500型）；CRYSTAL恒温振荡器（IS-RDS3）；默克milli-Q 超纯水系统；BUCHI 中压制备液相色谱（C-605型）；Eppendorf高速冷冻离心机（5425型）。

1.1.2试剂 青岛海洋化工厂柱层析用硅胶（200～300 目）；YMC 公司反相硅胶基C18 填料；天津致远化学试剂有限公司二氯甲烷、无水甲醇、无水乙醇、乙酸乙酯、石油醚（分析纯）；美国TEDIA 公司甲醇、乙腈（色谱纯）；上海吉至DNA 提取液（25∶24∶1）；上海吉至核酸提取液（24∶1）；索莱宝3 mol·L-1乙酸钠（pH 5.2）；诺唯赞2×Phanta Max Master Mix；Biowest琼脂糖；索莱宝50×TAE缓冲液。

1.1.3培养基配制 孟加拉红固体培养基：在1 L蒸馏水中加入36.7 g 索莱宝公司孟加拉红培养基，搅拌均匀后120 ℃高压灭菌20 min。PDB培养基：在1 L 蒸馏水中加入35 g 马铃薯葡萄糖粉末，搅拌均匀后120 ℃高压灭菌20 min。大米培养基：将50 g 大米与50 mL 蒸馏水加入500 mL 锥形瓶中，静置2 h 后120 ℃高压灭菌20 min。YES 固体培养基：酵母提取物20 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蔗糖150 g，ZnSO4·7H2O 10 mg，CuSO4·5H2O 5 mg，琼脂15.0 g，蒸馏水定容至1 L，搅拌均匀后120 ℃高压灭菌20 min。

1.2 实验方法

1.2.1菌种分离与鉴定 实验所用菌株Stilbellasp.分离自海南高山土壤，采用稀释平板法［11］对真菌进行分离。取200 mg土样置于装有小钢珠的1.5 mL EP 管中，加入800 μL 无菌水稀释破碎混匀，随后用无菌水稀释1 000倍，土壤浊液涂布在孟加拉红固体培养基上。当观察到有新菌落形成时，立即将其转接到PDA 固体培养基上，之后继续纯化以获得单一菌落。最后用20%甘油于-80 ℃保存菌株。菌株Stilbellasp.现保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号CGMCC 40422。

将真菌接种在YES 固体培养基上28 ℃培养14 d，总DNA 提取采用CTAB 法［12］。采用真菌ITS通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）作为上下游引物扩增ITS序列，引物由金唯智生物科技有限公司合成。每个PCR反应体系为（30 μL）：上下游引物各1.2 μL，稀释50 倍的总DNA 模板0.6 μL，2×Phanta Max Master Mix 15 μL，ddH2O 12 μL。PCR程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35 个循环；72 ℃终延伸5 min，4 ℃保存。取3 μL PCR 产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，成功扩增的PCR 产物送至金唯智生物技术有限公司测序，再用Vector NTI 软件将序列进行双向拼接。将获得的序列在NCBI 网站（www.ncbi.nlm.nih.gov）上进行Blast 比对，选取同源性较高的菌株序列，用MEGA 11.0 中的邻接法构建系统发育树，再用Bootstrap 对系统发育树进行检验，重复1 000次。

1.2.2发酵条件 用无菌接种环从Stilbellasp.菌株冻存管中挑取菌丝，接种到2 瓶装有250 mL PDB 锥形瓶中，28 ℃恒温振荡（120 r·min-1）培养3 d 作为种子液。将种子液接种至大米固体培养基中（每瓶50 g 大米，50 mL 纯水，120 ℃高压灭菌，共接种100瓶），室温下静置培养10 d。

1.2.3提取分离 将大米培养基发酵物干燥后进行机械粉碎，乙酸乙酯浸泡提取3次，合并提取液，减压浓缩得总浸膏。总浸膏经硅胶（200～300 目）柱层析（石油醚—乙酸乙酯，体积比1∶0→0∶1）梯度洗脱，运用薄层色谱法与高效液相分析（high performance liquid chromatography，HPLC）合并后得到9 个主流分Fr.1～Fr.9。其中Fr.2 经反相ODS柱层析（甲醇—水，体积比1∶9→1∶0）及半制备型HPLC（乙腈—水，体积比68∶32）纯化得到化合物3（2.1 mg）、化合物4（7.0 mg）、化合物5（4.8 mg）、化合物6（5.4 mg）和化合物8（7.3 mg）。Fr.5 经反相ODS 柱层析（甲醇—水，体积比1∶9→1∶0）及半制备型HPLC（乙腈—水，体积比57∶43）纯化得到化合物1（47.3 mg）和化合物2（5.9 mg）。Fr.7经反相ODS 柱层析（甲醇—水，体积比1∶9→1∶0）及半制备型HPLC（乙腈—水，体积比33∶67）纯化得到化合物7（4.6 mg）。

1.2.4烟曲霉酸含量测定 采用HPLC 对真菌发酵产物乙酸乙酯粗提物中主成分烟曲霉酸的含量进行测定，以纯化的烟曲霉酸作为对照品。HPLC条件：以60%色谱乙腈/水作为流动相，采用Eclipse Plus C18分析型色谱柱（100 mm×2.1 mm×3.5 μm），柱温25 ℃，流速0.35 mL·min-1，检测波长为230 nm，进样量2 μL。

仪器精密度实验。精密称取10 mg烟曲霉酸纯品于EP 管中，加入10 mL 色谱甲醇溶解，超声处理20 min，溶解为1 mg·mL-1。取该溶液300 μL，加色谱甲醇至1 mL，稀释至0.3 mg·mL-1，连续使用HPLC检测5次，统计各次化合物峰面积并计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值，以确认仪器精密度是否良好。

标准曲线的绘制。依次吸取上述1 mg·mL-1烟曲霉酸溶液100、200、300、400、500 μL于EP管中，再分别加入色谱甲醇至1 mL，超声处理20 min，得到主成分化合物对照品系列溶液。使用HPLC对上述系列对照品溶液检测并统计对应色谱峰的峰面积，然后将对照品的质量浓度（mg·mL-1）作为横坐标，对应的峰面积作为纵坐标，得出标准曲线方程。

稳定性实验。称取粗提物浸膏20 mg 于EP管中，加入色谱甲醇4 mL，超声处理20 min，溶解为5 mg·mL-1。吸取该溶液100 μL，加入色谱甲醇至1 mL，稀释至0.5 mg·mL-1。然后将该溶液于0、2、4、6、8 h重复进样。分别统计这5次测量的峰面积并计算RSD值，以确认样品溶液在8 h内是否稳定。

重现性实验。分别制备5份浓度为0.5 mg·mL-1供试品溶液，制备方法同稳定性实验。将5份溶液进行HPLC 检测。统计这5 次测量的峰面积并计算RSD值，以确认该测定方法是否具有良好的重现性。

加样回收试验。依次吸取上述1 mg·mL-1对照品溶液200、400、600 μL至EP管中，再分别加入色谱甲醇至1 mL，配制成0.2、0.4、0.6 mg·mL-1的对照品溶液。分别取对照品溶液各200μL至3个EP管中，再各自加入200 μL已知主成分含量的0.5 mg·mL-1粗提物供试品溶液，超声处理20 min。将3 份混合样品依次进行HPLC 测定，计算加入对照品的回收率。

烟曲霉酸含量测定。分别称取50 g大米制作21 瓶大米培养基，于菌株发酵第3、6、9、12、15、18、21 d各取3瓶，用1.2.3的方法提取浓缩后，溶解于100 mL 甲醇中。使用HPLC 检测各溶液，统计峰面积并得出烟曲霉酸与发酵时间的关系。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定结果

将菌株CGMCC 40422 经18S rDNA-ITS 基因测序后，在GenBank数据库中利用Blast进行同源性比对，发现该菌株ITS序列与Stilbella fimetaria（登录号FJ430712）和S. fimetaria（登录号为KX446764）相似性均为99%。进一步从GenBank数据库选择S. fimetaria及其近缘种的rDNA-ITS序列，与菌株CGMCC 40422 构建系统发育树。结果表明，菌株CGMCC 40422与S. fimetaria（登录号FJ430712）和S. fimetaria（登录号KX446764）处于同一分支上，可信度为62%，与其他近缘种有遗传距离（图1）。综合分析，将菌株CGMCC 40422初步鉴定为Stilbellasp.。

图1 菌株CGMCC 40422与近缘种的系统进化树Fig. 1 Phylogenetic tree of strain CGMCC 40422 and related varieties

2.2 化合物的结构鉴定

本研究从Stilbellasp. CGMCC 40422 的大米培养基发酵产物中共分离共得到8 个萜类化合物（图2），具体结构解析如下。

图2 化合物1～8的结构式Fig. 2 Structures of compounds 1～8

化合物1 为无色晶体，ESI-MSm/z： 567.2［MH］-，分子式为C33H44O8；1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.30（1H， d，J=10.0 Hz， H-1），5.84（1H， m， H-2），2.76（1H， m， H-4），2.25（1H， m， H-5），5.22（1H，m， H-6），2.60（1H， m， H-9），1.56～1.95（2H， m，H-11），1.80～2.40（2H， m， H-12），2.56（1H， m， H-13），1.89～2.22（2H， m， H-15），5.85（1H， m， H-16），0.91（3H， s， H-18），1.43（3H， s， H-19），2.47（2H， m， H-22），2.06～2.13（2H， m， H-23），5.09（1H， t，J=7.0 Hz， H-24），1.59（3H， s， H-26），1.68（3H， s， H-27），1.26（3H， d，J=6.8 Hz， H-28），1.17（3H， s， H-29），2.10（3H， s， H-2'），1.92（3H， s， H-4'）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：157.6（C-1），127.9（C-2），201.6（C-3），40.5（C-4），47.3（C-5），73.9（C-6），208.9（C-7），52.8（C-8），41.8（C-9），38.3（C-10，24.0（C-11），26.0（C-12），49.5（C-13），46.7（C-14），40.7（C-15），73.6（C-16），147.9（C-17），18.1（C-18），27.6（C-19），130.5（C-20），174.8（C-21），28.6（C-22），28.5（C-23），122.9（C-24），133.0（C-25），17.9（C-26），25.8（C-27），13.2（C-28），18.4（C-29），169.0（C-1'），20.8（C-2'），170.3（C-3'），20.6（C-4'）。上述数据与Fujimoto等［13］报道基本一致，故确定化合物1为烟曲霉酸。

化合物2：无色晶体，ESI-MSm/z：525.2［M-H］-，分子式为C31H42O7；1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.31（1H， d，J=10.0 Hz， H-1），5.85（1H， m， H-2），2.68（1H， m， H-4），2.23（1H， m， H-5），4.00（1H， m，H-6），2.56（1H， m， H-9），1.53～1.92（2H， m，H-11），1.74～2.41（2H， m， H-12，2.56（1H， m，H-13），1.84～2.21（2H， m， H-15），5.85（1H， m，H-16），0.94（3H， s， H-18），1.54（3H， s， H-19），2.42（2H， m， H-22），2.01～2.15（2H， m， H-23），5.09（1H， t，J=6.9 Hz， H-24），1.60（3H， s， H-26），1.68（3H， s， H-27），1.21（3H， d，J=6.7 Hz， H-28），1.12（3H， s， H-29），1.95（3H， s， H-2'）；13CNMR（150 MHz，CD3OD）δ：158.4（C-1），127.7（C-2），202.4（C-3），40.1（C-4），47.2（C-5），73.9（C-6），215.7（C-7），52.5（C-8），41.5（C-9），38.4（C-10），24.2（C-11），26.1（C-12），49.7（C-13），46.6（C-14），41.0（C-15），73.9（C-16），148.6（C-17），18.0（C-18），28.3（C-19），130.5（C-20），174.0（C-21），28.6（C-22），28.6（C-23），122.9（C-24），133.0（C-25），17.9（C-26），25.9（C-27），12.5（C-28），18.3（C-29），170.7（C-1'），20.5（C-2'）。上述数据与Zhu 等［14］报道基本一致，故鉴定化合物2为helvolinic acid。

化合物3：无色晶体，ESI-MSm/z：223.2［M+H］+，分子式为C15H26O；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：1.29～1.71（2H， m， H-2），4.24（1H， t，J=7.7 Hz，H-3），5.46（1H， m， H-5），1.83（1H， m， H-6），1.31（1H， m， H-7），1.45～1.73（2H， m， H-8），1.07～1.71（2H， m， H-9），1.61（1H， m， H-10）， 1.71（1H，m， H-11）， 0.89（3H， d，J=6.5 Hz， H-12），0.95（3H， d，J=6.5 Hz， H-13），0.87（3H， d，J=7.1 Hz，H-14），1.75（3H， s， H-15）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：46.2（C-1），32.8（C-2）， 69.1（C-3），137.6（C-4），125.6（C-5），36.5（C-6），61.4（C-7），27.5（C-8），30.0（C-9），48.0（C-10）， 31.6（C-11），23.5（C-12），24.0（C-13），14.5（C-14），19.4（C-15）。上述数据与Zhu 等［14］报道基本一致，故鉴定化合物3为tricho-acorenol。

化合物4：黄色油状液体，ESI-MSm/z：419.1［M-H］-，分子式为C23H29ClO5；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：2.58（3H， s， H-7），10.12（1H， s， H-8），3.33（2H， d，J=7.4 Hz， H-9），5.17（1H， t，J=7.4 Hz，H-10），2.00（2H， m， H-12），2.16（2H， m， H-13），5.44（1H， t，J=7.3 Hz， H-14），4.46 （1H， dd，J=10.3， 6.1 Hz， H-16），2.31～2.45（2H， m， H-17），1.79（3H， s， H-20），1.57（3H， s， H-21），1.16（3H，s， H-22），1.19（3H， s， H-23）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：114.4（C-1）， 139.6（C-2），114.8（C-3），159.4（C-4），116.0（C-5），162.9（C-6），14.6（C-7），195.3（C-8），22.8（C-9），123.4（C-10），135.5（C-11），40.1（C-12），26.7（C-13），128.8（C-14），134.5（C-15），79.1（C-16），40.8（C-17），219.1（C-18），81.8（C-19），16.2（C-20），11.4（C-21），22.2（C-22），24.6（C-23）。上述数据与Zhang 等［15］报道基本一致，故鉴定化合物4为ascofuranone。

化合物5：无色无定形粉末，ESI-MSm/z：405.2［M-H］-，分子式为C23H31ClO4；1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：2.60（3H， s， H-7）， 10.14（1H， s， H-8），3.36 （2H， d，J=7.2 Hz， H-9）， 5.26 （1H， t，J=7.2 Hz， H-10），1.84～1.98（2H， m， H-12），1.35～1.42（2H， m， H-13），1.97（1H， m， H-15），1.60～1.83（2H， m， H-16），2.33（2H， m， H-17），2.40（1H， m，H-19），0.56（3H， s， H-20）， 0.86（3H， d，J=6.7 Hz，H-21）， 0.88（3H， d，J= 6.7 Hz， H-22），1.83（3H，s， H-23）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：114.3（C-1），139.6（C-2），113.4（C-3），159.2（C-4），115.9（C-5），163.0（C-6），14.6（C-7），195.2（C-8），22.9（C-9），122.9（C-10），136.8（C-11），33.8（C-12），36.8（C-13），42.4（C-14），37.0（C-15），32.2（C-16），42.4（C-17），216.9（C-18），51.4（C-19），15.6（C-20），15.3（C-21），7.9（C-22），16.6（C-23）。上述数据与Singh 等［16］报道基本一致，故鉴定化合物5为ilicicolin C。

化合物6：黄色无定形粉末，ESI-MSm/z：371.2［M-H］-，分子式为C23H32O4；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.22（1H， s， H-3），2.46（3H， s， H-7），10.03（1H， s， H-8），3.85（2H， d，J=7.2 Hz， H-9），5.25（1H， t，J=7.3 Hz， H-10），1.90～2.05（2H， m，H-12），1.37～1.45（2H， m， H-13），1.98 （1H， m，H-15），1.63～1.83（2H， m， H-16），2.35（2H， m， H-17），2.40（1H， m， H-19），0.53（3H， s， H-20），0.85（3H， d，J=6.7 Hz， H-21），0.88（3H， d，J=6.8 Hz，H-22），1.79（3H， s， H-23）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：114.1（C-1），141.9（C-2），111.1（C-3），164.6（C-4），113.9（C-5）， 164.9（C-6），18.0（C-7），194.5（C-8），20.6（C-9），123.6（C-10），136.1（C-11），33.8（C-12），36.8（C-13），44.7（C-14），37.0（C-15），32.2（C-16），42.4（C-17），217.0（C-18），51.4（C-19），15.3（C-20），15.7（C-21），7.9（C-22）16.5（C-23）。上述数据与Singh等［16］报道基本一致，故鉴定化合物6为LL-Z1272Ɛ。

化合物7：黄色无定形粉末，ESI-MSm/z：421.2［M-H］-，分子式为C23H31ClO5；1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：2.58（3H， s， H-7），10.13（1H， s， H-8），3.32（2H， d，J=6.5 Hz， H-9），5.61 （1H， t，J=6.5 Hz，H-10），4.25（1H， dd，J=7.3， 5.1 Hz， H-12），1.46～1.67（2H， m， H-13），2.30（1H， m， H-15），1.57～1.80（2H， m， H-16），2.25（2H， m， H-17），2.53（1H， q，J=6.6， H-19），0.51 （3H， s， H-20），0.98（3H， d，J=6.7 Hz， H-21），0.70（3H， d，J=6.7 Hz，H-22），1.85（3H， s， H-23）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：114.4（C-1），139.9（C-2），114.8（C-3），159.3（C-4），115.0（C-5），162.7（C-6），14.6（C-7），195.4（C-8），22.4（C-9），124.8（C-10），140.1（C-11），75.3（C-12），42.0（C-13），44.9（C-14），37.4（C-15），32.1（C-16），42.5（C-17），216.5（C-18），51.3（C-19），16.2（C-20），15.8（C-21），8.7（C-22），11.3（C-23）。上述数据与Seephonkai 等［17］报道基本一致，故鉴定化合物7为deacetylchloronectrin。

化合物8：黄色无定形粉末，ESI-MSm/z：624.2［M-H］-，分子式为C31H43ClNO10；1H-NMR （600 MHz，CD3OD）δ：2.59（3H， s， H-7），10.13（1H， s， H-8），3.35（2H， m， H-9），5.65（1H， t，J=7.3 Hz， H-10），4.31（1H， dd，J=7.9， 4.4 Hz， H-12），1.62～1.78（2H， m， H-13），2.14（1H， m， H-15），1.50～1.80（2H， m， H-16），2.00（2H， m， H-17），2.48（1H，q，J=6.6， H-19），0.52（3H， s， H-20），1.00（3H，d，J=6.6 Hz， H-21），0.68（3H， d，J= 6.5 Hz， H-22），1.76（3H， s， H-23），4.77 （1H， m， H-1'），3.87（1H， m， H-2'），3.68（1H， m， H-3'），3.55（1H， m，H-4'），3.69（1H， m， H-5'）， 3.70～3.80（2H， m， H-6'），2.02（3H， s， H-2″）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δ：114.4（C-1），140.0 （C-2），114.5（C-3），159.4（C-4），114.9（C-5），162.6（C-6），14.6（C-7），195.4（C-8），22.5（C-9），129.8（C-10），135.6（C-11），78.7（C-12），40.5（C-13），44.8（C-14），37.2（C-15），32.0（C-16），42.4 （C-17），216.3（C-18），51.4（C-19），16.3（C-20），16.1（C-21），8.7（C-22），11.0（C-23），93.9（C-1'）， 55.2（C-2'），74.5（C-3'），72.5（C-4'），72.6（C-5'），62.8（C-6'），173.5（C-1''），22.6（C-2''）。上述数据与Subko 等［18］报道基本一致，故鉴定化合物8为ascochlorinN-acetylglucosamine。

2.3 烟曲霉酸的含量测定

2.3.1仪器精密度实验 5次进样测定0.3 mg·mL-1烟曲霉酸标准品（图3A）的峰面积依次为2 158.7、2 171.9、2 153.5、2 169.2 和2 197.4。经计算其RSD=0.8%，表明仪器精密度良好。

图3 烟曲霉酸产量的测定Fig. 3 Determination of helvolic acid yield

2.3.2绘制标准曲线 标准品浓度X与标准品吸收峰面积Y之间的回归方程：Y=6.528 8X+125.5，R2=0.998 4。烟曲霉酸质量浓度在0.1～0.5 mg·mL-1内与峰面积呈良好的线性关系（图3B）。

2.3.3稳定性实验 取0.5 mg·mL-1粗提物溶液（图3C）在0、2、4、6、8 h 重复进样测量的峰面积分别为2 723.2、2 746.3、2 753.3、2 761.3 和2 781.2。RSD 值为0.8%，确认样品溶液在8 h 内是基本稳定的。

2.3.4重现性实验 取5 份0.5 mg·mL-1的粗提物溶液分别进样，其吸收峰面积分别为2 715.2、2 724.9、2 714.7、2 771.1 和2 773.2。RSD 值为1.1%，确认此测定方法具有良好的重复性。

2.3.5加样回收试验 取质量浓度为0.5 mg·mL-1粗提物200 μL，分3批加入200 μL 0.2、0.4、0.6 mg·mL-1标准溶液，分别进样检测器峰面积，计算其回收率分别为99.2%、101.4%及102.1%，平均回收率为100.9%，RSD 值为1.5%，表明该测量方法的可信度较高。

2.3.6烟曲霉酸含量测定 将各组溶液的峰面积代入上述回归方程，计算不同发酵时间的烟曲霉酸含量（图3D）。结果表明，发酵6 d后，烟曲霉酸产量显著升高；发酵时间15 d时，烟曲霉酸的产量已经达到最大值2.98±0.09 g·kg-1。

3 讨论

本课题组筛选的真菌Stilbellasp. CGMCC 40422 具有较强的萜类化合物生产能力。使用大米培养基进行发酵后，获得了8个萜类化合物，其中主产物为烟曲霉酸。其中化合物1 和2 为C29原萜烷型四环三萜，化合物3为倍半萜，化合物4～8为杂萜类化合物。

据文献报道，1942年首次从烟曲霉菌分离得到烟曲霉酸，因其具有广泛的生物学活性而备受关注。烟曲霉酸属于梭链孢烷抗生素，来源于真菌，在原萜烯醇（protostadienol）的基础上经C-4β去甲基化、C-16β位乙酰氧化、C-20位甲基氧化成羧基等一系列修饰反应形成的四环三萜类化合物。作为梭链孢烷型抗生素的代表，烟曲霉酸具有显著抑制革兰氏阳性菌的活性［8］。2017年，姚新生等［19］系统地阐明了烟曲霉酸的生物合成途径，并测试了烟曲霉酸及其衍生物helvolinic acid抑制金黄色葡萄球菌的能力，最小抑制浓度（minium inhibitory concentration，MIC）分别为2.0 与0.5 μg·mL-1。Sanmanoch等［20］测试了烟曲霉酸对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、肺炎链球菌等细菌的抑制活性，最小抑制浓度均在16～32 μg·mL-1。Xiao等［21］发现烟曲霉酸对胰腺、肺、肝脏等癌细胞具有显著的抑制作用，在抗癌复合药物中有显著的协同增效作用。Xu 等［22］报道该化合物能通过抑制RANKL 诱导NFATc1 激活来减弱破骨细胞的形成和功能，从而抑制骨质疏松与骨溶解等疾病。

化合物4～8是一类由苔色酸与15个碳单位的萜类衍生物法尼基焦磷酸（farnesyl pyrophosphate，FPP）酯混合而成的真菌杂萜，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血脂等药理活性。2019年，日本Abe等［23］阐明了化合物4与5的生物合成途径。研究表明ascofuranone（化合物4）是药物开发中治疗癌症、泡球蚴病（Alveolar echinococcosis）和非洲锥虫病（African trypanosomiasis）的先导化合物。Gutiérrez等［24］报道ilicicolin C（化合物5）对豆薯细菌性叶斑病病原菌Pseudomonas syringae具有抑制作用，IC50值为28.5 mg·mL-1，与链霉素和青霉素的活性相当。

CGMCC 40422 粗提物的HPLC 分析图谱显示，烟曲霉酸的含量最高。通过高效液相色谱法测定烟曲霉酸含量，在培养15 d 后产量达最大值3 g·kg-1。徐帆等［25］对来源于海洋的烟曲霉菌CY018发酵生产烟曲霉酸的培养基进行了优化，最终产量达54.81 mg·L-1。谭雁鸿等［26］选用软珊瑚真菌Eupenicilliumsp. DX-SER3 经大米培养基发酵后提取，最终烟曲霉酸的产量为156.25 mg·kg-1。本文研究菌株的烟曲霉酸生产能力远高于其他菌株，展现出了强大的萜类化合物生产能力，推测其萜类天然产物合成的上游途径（如MVA 途径）合成能力强，萜类合成前体（如法尼基焦磷酸、2，3-环氧鲨烯）供应充足。此外，CGMCC 40422 能够高效生产烟曲霉酸等萜类化合物，推测部分修饰萜类骨架的P450 酶在该菌中表达能力强。未来如果能建立稳定的遗传操作系统，则可进一步开发为底盘细胞，低成本发酵生产有价值的萜类化合物如灵芝酸、甘草次酸等。