应用高压冷冻-冷冻替代技术研究Erastin 对颗粒细胞超微结构的影响

王珍 ， 黄克让 ， 陈蕾 ， 周敏 ， 薛元夏

1.西北农林科技大学，生命科学大型仪器共享平台，陕西 杨凌 712100；

2.杨凌职业技术学院生物工程学院，陕西 杨凌 712100

哺乳动物卵细胞发育是一个复杂、动态的过程，卵巢颗粒细胞是卵细胞正常发育及功能正常发挥的重要支持细胞，也是为卵细胞提供营养环境的主要媒介。卵巢颗粒细胞是判断卵细胞发育是否异常的关键，卵母细胞可以通过颗粒细胞获得85%的营养物质，同时卵巢颗粒细胞是研究雌性生殖细胞生物学及其功能调控的重要模型［1-2］。90%的哺乳动物卵泡在发育过程中存在闭锁，新的研究发现在卵泡闭锁中还存在典型的铁死亡，诱导或促进细胞铁死亡成为很有前景的肿瘤治疗研究方向。目前对颗粒细胞凋亡的研究较多，多集中在功能和分子水平层面［3-5］，并以生物电镜技术辅助验证，但关于铁死亡方面的研究却很少［6-8］。借助电镜技术对细胞超微结构的研究已有将近六七十年的历史，也为细胞形态学研究提供了重要的研究手段。传统的电镜观察需要用化学试剂对样品进行常规化学固定（chemical fixation，CF），但固定时间长、固定速度慢，如常用的戊二醛固定速度为0.27 mm·h-1，因此要求取样速度快、取材小、固定过程快，固定后还要经过漂洗、脱水、渗透、包埋、聚合等一系列操作，操作过程多且繁杂，极易使样本细胞成分转移或者损失，造成细胞超微结构失真［9］。高压冷冻-冷冻替代（high pressure freezing-freezing substitution，HPF FS）技术因独特的原位固定优势使其成为当前电镜样品制备技术的热点，其中最大的优点是能够在2 100 bar 下30 ms 终止一切细胞内的生命活动，将生物组织和细胞内所有结构和成分瞬间玻璃化从而实现固定，因此有效避免了化学固定造成的各种生物学假象［10-11］。基于此，为了更真实地研究铁死亡诱导剂对卵巢颗粒细胞超微结构的影响，本文运用HPF-FS 技术从微观角度展开研究，以期为颗粒细胞的铁死亡调控机制及其介导卵泡发育等相关研究提供更多思路和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

本研究所用的猪卵巢（Z）和牛卵巢（N）均来自于周至县屠宰场，采集后用生理盐水快速冲洗并储备于双抗（青、链霉素100 IU·mL-1，索莱宝）生理盐水的保温桶中，2 h内运回实验室将猪卵巢（Z）和牛卵巢（N）剖开，提取其中直径3～8 mm 卵泡内的颗粒细胞于含10%的胎牛血清DMEM（Thermo，美国）中重悬，1 200 r·min-1离心5 min，取上清；再1 200 r·min-1离心5 min，收集细胞沉淀，用DMEM 洗2～3 遍，收集颗粒细胞置于6 孔板中进行细胞培养，37 ℃ 5% CO2条件下培养24 h后观察细胞状态和密度，待细胞密度达到80%～90%时，用于下一步试验。

1.2 试验方法

1.2.1颗粒细胞的培养 将猪颗粒细胞和牛颗粒细胞按照2×103个·100 μL-1接种量分别传代至6孔板中，其中处理组（T）加入Erastin（浓度为10 μmol·L-1）分别记为T-Z、T-N，另设置空白的对照组（CK）分别记为CK-Z、CK-N。每组处理重复15次。

1.2.2CCK-8 法检测颗粒细胞的增殖活力 将猪颗粒细胞和牛颗粒细胞培养24、48 h，使用CCK8 胞计数检测试剂盒（KGA317，江苏凯基）。培养24、48 h后弃掉培养基，每孔加入预先配制好的CCK-8 溶液100 μL 继续孵育1 h，酶标仪检测450 nm波长下读取各孔吸光度值，每组4个重复。

1.2.3ATP含量测定 用生物发光法检测试剂盒检测ATP 含量（S0027，碧云天）。细胞培养48 h后，每个6 孔板加100 μL 裂解液裂解细胞。样品裂解全程在冰上操作。将配置好的ATP 标准溶液（4 μL）和待测液（4 μL）与ATP 检测工作液（100 μL）混匀，取100 μL 测定吸光值，按标准曲线计算ATP浓度。

1.2.4ROS 含量测定 ROS 测定试剂盒（E004，南京建成）测定ROS 含量。不含血清培养液以体积比1∶1 000 加载DCFH-DA 探针，接种至6 孔板中，37 ℃环境孵育30 min，用PBS 离心洗涤2 次，化学发光免疫分析仪在激发波长488 nm、发射波长525 nm 处测定经氧化后的绿色荧光强度，即代表ROS含量的相对吸光度值。

1.2.5颗粒细胞的电镜观察 取培养48 h的颗粒细胞CK-Z、CK-N、T-Z、T-N 用0.2%胰酶（Sigma 公司，美国）将细胞消化下来用于透射电镜样品制备。①高压冷冻-冷冻替代（HPF-FS）制样后电镜观察。分别将对照组（CK-Z、CK-N）、处理组（TZ、T-N）的细胞样品迅速装入200 μm 深度的镀金样品承载盘中，加入冷冻保护剂Hexadecane（Sigma 公司，美国）覆盖样品，盖上样品盖，进行高压冷冻（EM ICE，Leica 公司）。高压冷冻固定后迅速将样品拿出，转移至预先加有液氮的样品转移操作台中，再迅速转入1%锇酸-丙酮冷冻替代液中，最后置于冷冻替代仪（EM AFS2，Leica 公司）中设置开启替代程序，替代温度从-90 ℃开始缓慢升至常温［10］，结束后转至常温进行梯度渗透和包埋，超薄切片机（EM UC7，Leica公司）进行超薄切片（厚度70 nm），再经铀铅双染后在透射电子显微镜（HT7800）下观察拍照。②常规化学固定（CF）制样后电镜观察。将对照组（CK-Z、CK-N）、处理组（T-Z、T-N）的细胞样品放入预冷的2%多聚甲醛-2.5%戊二醛溶液中常温固定0.5 h，然后放入4 ℃冰箱固定5.5 h 进行常规透射样品制备，分别用0.1 mol·L-1磷酸缓冲液漂洗→1%锇酸后固定→0.1 mol·L-1磷酸缓冲液漂洗→乙醇梯度脱水→丙酮置换乙醇→树脂剃度渗透→包埋→聚合→切片→染色→电镜观察。

1.2.6统计学分析 采用统计学软件SPSS 26.0对数据进行分析，并进行正态性检验和方差齐性检验，使用方差分析（ANOVA）进行评估以5%的概率使用显著性差异（LSD）检验，以P＜0.05 表示在统计学上有意义。

2 结果与分析

2.1 CCK8法测定细胞增殖结果

如表1 所示，以CCK-8 法检测细胞活性，发现牛颗粒细胞在贴壁24 h，与对照组比，处理组OD450降低但无显著差异；而在48 h 时，处理组与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。Erastin 处理的猪颗粒细胞贴壁生长24、48 h的OD450与对照组相比差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

表1 Erastin处理对颗粒细胞增殖的影响Table 1 Effect of Erastin treatment on proliferation of granulosa cells

2.2 ATP和ROS检测结果

由表2 可知，与对照组相比，牛颗粒细胞处理组ATP 含量（7.37 μmol·L-1）、猪颗粒细胞处理组ATP 含量（5.88 μmol·L-1）均显著降低，说明铁死亡诱导剂处理后使线粒体受损，功能下降。同时处理组牛颗粒细胞的ROS 水平和猪颗粒细胞的ROS 水平分别比对照组显著提高，表明细胞内ROS 浓度明显提升，ATP 和ROS 检测结果均表征颗粒细胞出现铁死亡。

表2 Erastin处理对颗粒细胞ATP和ROS水平的影响Table 2 Effects of Erastin treatment on ATP and ROS levels in granulosa cells

2.3 不同固定方法对牛颗粒细胞超微结构的影响

CF 制备的牛颗粒细胞结构保存基本完整，细胞内可见细胞核、核孔、线粒体、脂滴等结构，但细胞器及内容物分辨困难，主要表现在细胞核双层膜结构模糊，核染色质边集、核孔不清晰，部分线粒体嵴溶解并出现空泡，内质网、高尔基体难以辨识，细胞质有不同程度的抽提及细胞内结构颗粒感重（图1）。通过HPF-FS 制样的颗粒细胞内超微结构保存完整，各类细胞器结构清晰，细胞内线粒体、自噬体（白色箭头）等细胞器清晰可见，电子密度高且对比度强，细胞双层核膜及核孔清晰可见，线粒体嵴及高尔基体片层清楚，并能明显观察到高尔基体小囊泡的形成，高尔基复合体发达；胞浆中富含小囊泡状滑面内质网；脂滴圆滑并与自噬体明显区别，部分自噬体中包裹的细胞器可辨认（图1）。但与CF 相比仍存在一些问题，如细胞核存在一定形变，样品得率较低，这与张宾等［12］应用HPF-FS 研究脑片超微结构发现的问题相类似。

图1 不同固定方法对牛颗粒细胞超微结构的影响Fig. 1 Effect of different fixation methods on the ultrastructure of bovine granulosa cells

HPF-FS 制备的对照组（CK-N）和处理组（TN）细胞的超微结构均有良好的保存效果，胞质内的亚细胞器及胞质结构保存得更完整细腻。HPF-FS 制备的CK-N 组和T-N 组细胞内线粒体分别与CF 制备的CK-N 组和T-N 组获得的线粒体形态无明显差异。但是HPF-FS 制备下可以明显看出T-N 细胞与CK-N 细胞超微结构的差异，T-N 组的线粒体形态明显变小、嵴数量减少或者断裂且细胞出现空泡化现象；但CF 制备的T-N组细胞空泡化现象不明显，内质网结构不易分辨，分泌小泡膜结构不清楚甚至已经破裂，可能是细胞质没有得到很好的固定和保存且胞内空泡出现破裂导致，因此采用HPF-FS 制样能更好地保存细胞的超微结构，摆脱化学固定的假象干扰。

2.4 Erastin处理对牛颗粒细胞线粒体的影响

电镜下可以看到牛颗粒细胞的细胞结构保存完整。从图2 可知，对照组（CK-N）的线粒体形态圆滑，嵴呈条状分布且排列紧密均匀，胞质密度均匀；而处理组线粒体数量增加，但形态明显减小、线粒体嵴排列疏松或者断裂，线粒体嵴数量明显减少。

2.5 不同固定方法对猪颗粒细胞超微结构的影响

HPF-FS 制备的猪颗粒细胞超微结构保存完整，胞浆内可见丰富的线粒体、高尔基体、内质网、自噬体等细胞结构，线粒体内嵴及高尔基体片层清楚，且能观察到高尔基体分泌的小囊泡，细胞核双层膜及核孔结构清晰，核染色质分布均匀，粗面内质网及滑面内质网可明显区分且含量丰富，自噬体结构（白色箭头）完整且包裹物清楚可见（图3）。与HPF-FS 相比，CF 下细胞超微结构明显有一定程度损伤和缺失，主要表现在胞浆内可分辨细胞器较少，细胞核染色质聚集且双层膜结构模糊，线粒体嵴不易分辨，内质网结构模糊不易辨识，自噬结构里面的包裹物不易辨别（图3）。总体来讲，HPF-FS 技术对保存颗粒细胞瞬时生理状态具有十分显著的作用。

图3 不同固定方法对猪颗粒细胞超微结构的影响Fig. 3 Effect of different fixation methods on ultrastructure of porcine granulosa cells

对照组（CK-Z）和处理组（T-Z）细胞分别在两种制样方式CF和HPF-FS的细胞形态、细胞核、线粒体形态大小无明显差异。HPF-FS 制备的对照组（CK-Z）和处理组（T-Z）细胞的超微结构均保存得更完整细腻，可以明显看出T-Z 细胞与CK-Z 细胞超微结构的差异，处理组的线粒体形态明显变小，部分发生形变，细胞出现空泡化，内质网结构有所减少。这与CF 制备下的T-Z 的线粒体变化一致，但CF 制备下的T-Z 细胞胞质内多糖和蛋白结构已经被破坏导致细胞胞质颗粒感重，内质网结构辨识度不高，高尔基体结构无法清晰识别，影响实验的准确性。

注：M—线粒体；L—脂滴；Nuc—细胞核；E—内质网。

2.6 Erastin处理对猪颗粒细胞线粒体的影响

电镜下可以看到HPF-FS 制样获得的两组猪颗粒细胞结构保存丰富、完整，线粒体、高尔基体、脂滴、粗面内质网、滑面内质网、细胞核结构清晰可辨。与对照组（CK-Z）相比，处理组（T-Z）线粒体膜固缩，膜密度增加，嵴断裂严重或者消失，线粒体形态明显减小（图4），说明颗粒细胞功能损害严重。

图4 Erastin处理对猪颗粒细胞线粒体的影响Fig. 4 Effect of Erastin treatment on the mitochondria of porcine granulosa cells

3 讨论

当前关于颗粒细胞的研究较多，有研究发现卵巢颗粒细胞凋亡和自噬是卵泡闭锁的主要原因［3-4，13］。但很少有文献报道卵巢颗粒细胞铁死亡调控卵泡闭锁的作用机制［5］。本文通过Erastin诱导颗粒细胞铁死亡，试验发现加入铁死亡诱导剂Erastin 共培养24 h 时，猪颗粒细胞生长明显受到抑制，牛颗粒细胞生长与对照相比差异不显著；但共培养48 h的牛颗粒细胞和猪颗粒细胞增殖与对照组相比均受到显著影响。同时发现Erastin诱导颗粒细胞培养48 h后与对照组相比牛颗粒细胞和猪颗粒细胞ATP 含量显著降低，ROS 水平显著增高，说明颗粒细胞线粒体受损，这与丛培玮等［8］的研究结果相符。细胞在氧代谢过程中会不可避免地产生活性氧基团（ROS），若不能被及时清除，大量累积后便会攻击生物膜，造成脂质过氧化，Lee 等［14］也发现Artesunate 和Erastin 影响谷胱甘肽的产生或利用，并诱导氧化应激反应使血红素加氧酶和脂质过氧化水平增加。颗粒细胞是卵泡的主要功能细胞，颗粒细胞中线粒体含量丰富，能够调节卵泡内ATP 水平，是卵泡发育的重要能量来源，也为卵细胞的发育成熟提供了大量细胞因子和生长因子［15］。在卵母细胞凋亡过程中，线粒体在卵母细胞成熟和胚胎发育中起重要作用，它参与众多生长发育所需要的蛋白质和氨基酸以及甾类激素的合成［16-17］，卵母细胞老化过程伴随着线粒体功能紊乱，这种紊乱最终会诱导卵母细胞凋亡。因此，线粒体结构和功能的稳定性对卵细胞的发育至关重要。本试验在电镜观察中也发现处理后的牛颗粒细胞和猪颗粒细胞的线粒体均出现形态减小或者变形，线粒体嵴断裂或者消失，均指示细胞发生铁死亡，与前面测试指标相符，颗粒细胞超微结构的变化会造成其分泌功能的异常进而影响卵泡发育，因此也可作为鉴定卵泡发育状况的重要手段。

HPF-FS 技术是近年来生物电镜领域的新技术，能够固定样品的瞬时生理状态，相比于传统化学固定，对样品超微结构的保存有无法替代的优势。目前HPF-FS 技术广泛用于动植物常规组织、细胞、酵母、病毒等［18-22］研究中，但在动物生殖及生殖相关细胞尤其是颗粒细胞中的研究较少。HPF-FS 技术是在2 100 bar 下30 ms 内将样品迅速固定将样品里的液态水玻璃化，再用冷冻替代剂从-190 ℃缓慢升温替代样品中的水，较少的化学试剂使用减少了对细胞内容物的抽提，最后再进行树脂渗透和包埋，能更好的保存样品最真实的超微形态，为细胞超微结构的研究提供了更加清晰、真实的数据，与传统化学固定相比具有非常显著的优势。然而，HPF-FS 技术在实际操作过程中同样存在一些需要进一步完善的地方：首先要避免实验操作过程中空气含水量过高，使操作环节产生大量冰晶刺破细胞，导致细胞结构受损，影响后期观察；其次，高压冷冻过程中存在样品厚度不均匀使得细胞所受压力不同，表现为细胞膜不圆滑且有的地方凸起，有时甚至使细胞破裂内容物外流［12］，这与在牛颗粒细胞的结果相符。从本研究结果可以看出，HPF-FS 技术较CF技术可以更好地保存细胞的线粒体、高尔基体、内质网、自噬等超微结构，清楚地看到自噬泡中的包裹物、高尔基体的吞吐小泡变化趋势。同时我们也发现不同物种的颗粒细胞超微结构存在差异，相比而言，猪颗粒细胞的内质网、核糖体较丰富；Erastin 处理后细胞出现空泡化，内质网结构没有对照组分布丰富，这可能与内质网应激导致自噬体形成［14］有关。HPF-FS 制备的颗粒细胞相比CF 而言在内质网、自噬等结构上保存的更加完好，这是在常规化学制样中不易观察到的。颗粒细胞凋亡是诱导卵泡闭锁的主要原因，卵泡闭锁又会导致卵巢早衰，内质网应激在整个调控中有着非常重要的作用［13，23-24］，也有众多研究发现自噬能够调节颗粒细胞增殖和凋亡程度［25-26］，因此细胞超微结构的变化为颗粒细胞凋亡及介导卵泡发育等相关研究提供了更多思路和参考。综上所述，HPF-FS 技术能更加真实全面地展现细胞的超微结构，可为研究颗粒细胞的分子机制提供新的思路、依据和技术积累。