肺炎支原体药物敏感性和难治性肺炎支原体肺炎患儿发病的关系分析

胡祖霞，杨中桥

（开封市儿童医院 急诊科，河南 开封 475000）

患儿在发生肺炎支原体感染后，如果未能得到及时有效的对症治疗，易并发肺部疾病，其中最为常见的一种即为难治性肺炎支原体肺炎（refractoryMycoplasma pneumoniaepneumonia,RMPP），RMPP 主要表现为心肌炎、胸腔积液以及肺坏死等，严重者会导致多脏器衰竭，对儿童的健康成长造成极大危害［1-2］。大环内酯类抗生素（macrolide antibiotics,MA）作为临床上常用的药物被广泛应用于治疗患儿RMPP，但RMPP 的发病机制在临床上尚未得到统一。相关研究认为RMPP患儿的患病程度与感染肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae,MP）的多少以及机体产生的免疫反应有关，也有研究认为患儿病情加重的原因与MP 对MA 的耐药性有关［3-5］。因此，本研究将对从患儿支气管肺泡灌洗液中提取的MP DNA 的23S rRNA基因片段做测序，而后将测序结果与MP 标准株进行对比分析，以期进一步明确MP 药物敏感性与RMPP 患儿发病之间的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

84 例RMPP 患儿选自于开封市儿童医院在2018 年3 月至2020 年3 月收治的儿童，根据胸部影像检查及临床症状将其分为GMPP 组（n=35）以及RMPP 组（n=49）。其中，GMPP 组男20 例（占57.14%），女15 例（占42.86%）；年龄2～12 岁，平均（5.25±2.15）岁；病程4～15 d，平均（7.54±2.06）d；RMPP 组男27 例（占55.10%），女22 例（44.90%）；年龄1～13 岁，平均（6.54±2.46）岁；病程3～16 d，平均（8.13±2.15）d；上述资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。纳入标准：患儿的诊断标准依据《儿童肺炎支原体肺炎中西医结合诊治专家共识（2017 年制定》［6］和《难治性肺炎支原体肺炎诊治中应关注的问题》［7］制定，排除标准：合并其他呼吸道感染疾病；免疫低下患儿；具有哮喘病史及肺结核患儿。本研究已通过院伦理委员会批准，且患者及其家属知晓研究过程及内容。

1.2 方法

1.2.1 支气管肺泡灌洗液标本采集 令患儿采取平躺的方式进行支气管镜检查，镇静剂选择呋麻滴鼻液滴鼻、咪达唑仑，为使支气管镜能够顺利达到病灶，适当的在支气管镜上涂抹丁卡因胶浆。由专业医师使用BF-IT290 电子支气管镜（江苏安茂医疗科技有限公司）由患儿鼻孔一侧入镜，添加利多卡因麻醉的同时逐步深入直至到达患儿的病变部位，而后使用NaCl 溶液（浓度为0.9%）进行支气管肺泡灌洗，连续进行3 次上述操作，注意3 次操作的使用的灌洗液总量≤10 mL/kg，将痰液收集器进行无菌处理，并将其连接在支气管镜操作孔道，负压100～150 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）进行抽吸，通过此种方式采集来患儿的支气管肺泡灌洗液标本。GMPP 组其余26 例患儿采集鼻咽吸出物标本，由专业护士给患儿清洁鼻腔，而后将无菌吸痰管深入鼻孔约7～8 cm 直至咽喉部位，用无菌负压吸痰器将鼻腔抽吸物吸出以获得鼻咽吸出物标本。获取标本后将其立即送往生化试验室进行病理、病原学等检测。

1.2.2 MP 23S rRNA 基因检测 MP 23S rRNA 基因的检测使用实时荧光定量RCR 法进行（试剂盒来源于中山大学达安基因股份有限公司），对鼻咽吸出物及支气管肺泡灌液标本中的MA DNA 进行检测，拷贝数超过1×106copies/L 即为阳性。采用Step one plusTM定量PCR 仪（美国）对以上检测为阳性的标本与MA 标准株的MP 23S rRNA 进行定量检测，将其扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司做测序，将获取的序列结果与MP 23S rRNA 的基因排序作比较。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0 统计软件进行数据处理。正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，用t检验，非正态分布的计量资料以M（P25,P75）表示，用Wilcoxon 秩和检验；计数资料以百分率（%）表示，用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR 扩增结果

MP 23S rRNA 基因引物PCR 扩增后结果表明，49 例RMPP 患儿以及35 例GMPP 患儿的支气管肺泡灌洗液标本和鼻咽吸出物标本获得的基因片段大小均为244 bp。见图1。

图1 部分MP V 区MP 23S rRNA PCR 扩增产物电泳图

2.2 基因测序结果及基因变异情况

49 例RMPP 患儿支气管肺泡灌洗液标本的PCR 扩增产物中，与MP 标准株23S rRNA 的排序相同的有2 例，并未检测出位点突变，见图2。47 例在2063 位A-G 的发生耐药基因突变，突变率为95.92%，未出现2064 位A-G 的突变和2063位A-T 的突变，见图3。35 例GMPP 患儿支气管肺泡灌洗液标本和鼻咽吸出物标本的PCR 扩增产物中，与MP 标准株23S rRNA 的排序相同的有6 例，并未检测出位点突变；其他的29 例亦均存在2063 位A-G 的耐药基因突变，突变率为82.86%，未出现2064 位A-G 的突变和2063 位A-T的突变。故两组患儿（n=84）发生MP 23S rRNA基因突变的共76 例，突变率为90.48%，且突变均以2063 位点A-G 的突变为主。

图2 MP 标准株的基因测序（不存在位点突变）

图3 23S rRNA 基因2063 位A-G 位点突变的测序图

2.3 两组患儿的临床特点比较

根据MP 耐药基因的突变情况分为MA 敏感组（n=8）和MA 耐药组（n=49），比较结果显示：MA 耐药组发热时间较MA 敏感组长，差异有统计学意义（P＜0.05）；MA 敏感组患儿糖皮质激素的使用率为37.50%，MA 耐药组使用率为76.32%，比较差异有统计学意义（P＜0.05）；8 例MA 敏感组患儿中RMPP 的发生率为25.00%，76 例MA 耐药组患儿中RMPP 的发生率为61.84%。见表1。

表1 MA 耐药组和敏感组MPP 患儿的各项指标比较

3 讨论

近年来，据相关研究统计显示：RMPP 已经成为儿童中的主要肺部疾病，对患儿的生命安全造成严重威胁［8］。MA 因其使用方便、不良反应发生率低的特点，已成为临床治疗RMPP 患儿的主要药物。但有报道表明，MP 对MA 发生耐药的情况日趋增多，我国尤其严重，导致有些患儿在MP 感染后选取治疗药物不合理。由于MP 培养时间长且生长条件极为苛刻，因此传统的MP 药物敏感试验耗时较长［9-11］。本研究通过检测MP 基因以判定耐药基因序列情况，进一步判定MP 耐药是否更加灵敏和快速，以期为MPP 临床治疗中抗生素药物的使用提供参考。

本研究结果表明：①MA 敏感组和MA 耐药组患儿中性粒细胞比例、白细胞数、C 反应蛋白、淋巴细胞亚群、肌酸激酶同工酶、丙氨酸转氨酶等指标比较差异无统计学意义（P＞0.05）。在陈煜等［12］的研究中，MPP 患儿血液中的C 反应蛋白、中性粒细胞比例、丙氨酸转氨酶等指标在MA 敏感组和MA 耐药组中的比较差异无统计学意义（P＞0.05），他们把肺部影像学特征分为4 种类型，即磨玻璃样渗出、单纯的肺门淋巴肿大、点片状浸润以及大叶性实质浸润，上述类型比较差异无统计学意义（P＞0.05），与本文研究结果一致。且经胸部X 线检查结果表明：两组患儿大叶性肺炎、支气管肺炎以及伴胸腔积液的发生率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。故若将化验结果以及胸部影像学特征用于判定肺炎种类是否是耐药MA 所导致的，不利于临床治疗方案的决策。②MA 耐药组患儿RMPP 的发生率显著较MA 敏感组高（P＜0.05），提示MP 对MA 耐药一定程度上提高了RMPP 的发生率，应提高对RMPP 的临床耐药监测，选择合理的抗菌药物，与既往JIN 等［13］的研究保持一致。原因可能是MPP 患儿中性粒细胞比例增高，表明MP 对中性粒细胞具有激活作用，进而诱发了患儿体内的体液和细胞免疫反应；RMPP患儿机体内CD3-CD8+T 淋巴细胞等比例明显增加，提示部分免疫异常变化进一步加速了炎症的产生，从而增加了RMPP 的发生［14］。③两组患儿发生MP 23S rRNA 基因突变的共76 例，突变率为90.48%，且突变均以2063 位点A-G 的突变为主，提示MP 对MA 耐药的主要分子基础是23S rRNA V 区2063 位点的突变，与姚慧生等［15］的研究结果保持一致。

综上所述，RMPP 患儿的气管肺泡灌洗液标本中MP 对MA 的药物敏感性比较高，均为MP 23S rRNA V 区2063A-G 位点的突变。临床上需要时刻对RMPP 患儿的耐药性进行监测，以及时选择合理的药物。