宫颈癌患者血清miRNA-34a表达水平研究

钟银雪，刘宓，陈海星，陈学书，李觅

（贵州医科大学附属肿瘤医院 医学检验科，贵州 贵阳 550004）

宫颈癌是世界上第二常见的妇科肿瘤。在发展中国家，宫颈癌的发病率远高于发达国家，病例数占世界宫颈癌总数的80%［1］。近年来，随着我国社会经济的发展、人们性观念、生活习惯的改变，发现宫颈癌发病年龄呈现年轻化趋势，发病率逐年上升［2］。高危型人类乳头状瘤病毒（highrisk human papillomavirus,HR-HPV）持续感染是宫颈癌的主要病因。其中HPV E6，E7 致癌蛋白在宫颈癌发生发展中发挥重要作用。宫颈癌时，HPV 病毒感染人体，HPV 基因组整合到宿主细胞，诱导HPV-E6 蛋白表达。E6 蛋白靶向结合P53 基因，通过泛素蛋白酶途径降解P53，导致P53 有效性降低，P53 失活导致可与miR-34a 结合位点的启动区域的蛋白数量的减少，从而下调大多数被HPV 感染的组织中miR-34a 的表达。进而调节细胞凋亡、使G1 期阻滞、DNA 修复和凋亡的蛋白失活，导致细胞增殖，促进肿瘤的发生［3］。

miR-34 家族（miR-34s）是一组高度保守的miRNA 家族，广泛存在于节肢动物、线虫纲动物及哺乳动物中。人源miR-34 家族包括miR-34a、miR-34b、miR-3c［4］。其中miR-34a 是miRNA 家族中一类高度保守的非编码RNA，也是一种抑癌基因，它可通过靶定多种周期及凋亡相关蛋白mRNA 的3＇UTR 区而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，使这些蛋白的mRNA 降解，细胞周期不向S 期转换，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，从而抑制肿瘤的发生。反之如果miR-34a 表达降低，将会导致细胞增殖失控，凋亡抑制，最终形成肿瘤［5］。WANG 等［6］研究发现，HPV 能通过E6 癌基因直接和间接地影响miR-34a 使其表达下调。相反沉默宫颈癌细胞系E6 后，p53 和miR-34a 表达增多。有研究报道，miR-34a 表达从宫颈上皮内瘤变到宫颈癌逐渐下调，低的miR-34a 水平可能与病毒的整合、E6 蛋白的表达及P53 缺失有关［7］。

很多研究表明miR-34a 不仅在宫颈癌中表达异常，在多种癌症包括肺癌及结直肠癌中也有异常表达。赵艳争［8］发现，miR-34a 在肺癌患者血清中的表达水平明显上调；OKADA 等［9］发现miR-34a 可抑制抑癌基因p53 负调节因子HDM4 表达，进而作用于p53 和miR-34a 形成的正反馈环，抑制肺癌进展。雒亚蒙等［10］发现结肠癌患者的血清miR-34a 基因表达水平较结肠腺瘤性息肉组和健康对照组显著降低。赵春娟等［11］发现前列腺癌患者的血清miR-34a 基因表达水平较前列腺增生组和健康对照组显著降低。从上述研究中可以发现，miR-34a 在不同肿瘤中表达趋势并不相同，在同一肿瘤不同疾病期，表达水平也存在差异。因此，这提示miR-34a 在各肿瘤中的致病机制可能并不相同。

本研究组之前通过分析HPV 感染宫颈癌患者宫颈细胞miR-34a 表达水平发现，HPV 阳性宫颈癌患者miR-34a 表达水平较宫颈炎和健康人群明显升高，提示miR-34a 可能做为观察宫颈癌发生发展的指标［12］。相较于宫颈细胞样本，血清样本更易获得，但血清miR-34a 来源于全身各组织和器官，宫颈癌时其表达水平是否与宫颈细胞一致，值得探讨；不同肿瘤时，血清miR-34a 水平变化趋势是否一致，也值得研究。

因此，研究拟通过检测贵州医科大学附属肿瘤医院宫颈癌患者血清miR-34a 的水平，探讨血清miR-34a 水平在宫颈癌中的可能变化；并与肺癌、结直肠癌以及健康人群血清miR-34a 水平进行比较，分析各组血清miR-34a 表达水平的变化趋势，探讨血清miR-34a 可能具有的临床价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2020 年10 月至2021 年3 月在贵州医科大学附属肿瘤医院收治的宫颈癌患者20 例（年龄23～67 岁），并纳入同期健康体检人群20 例（年龄21～77 岁）作为健康对照组，另纳入确诊的肺癌（年龄48～83 岁）和结直肠癌（31～80 岁）患者各20 例作为疾病对照。宫颈癌患者、肺癌患者、结直肠癌患者均依据临床病理结果进行诊断，所有纳入研究的患者入院前均未接受任何治疗。本研究通过了贵州医科大学附属肿瘤医院伦理委员会审查（伦理审批号：SL-20205088）。

1.2 实验试剂与仪器

TAKARA RNAiso for Small RNA、Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis 和 SYBR Green qRT-PCR试剂（日本宝生生物技术有限公司）。miR-34a 特异性引物（易锦生物有限公司）、异丙醇、75%乙醇、RNase-free 水等。ABI7500 实时荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems 公司）、BIOER Life Express 基因扩增仪（杭州博日科技有限公司）、离心机。

1.3 miR-34a 的检测方法

血清总RNA 提取：采用促凝真空采血管采集4 组人员静脉血5 mL 3 000 rpm 离心10 min，吸取血清于无RNA 酶的EP 管中，标记好患者姓名，保存于-20℃冰箱备用。取500 μL 的血清加入1 000 μL 的RNAiso for Small RNA 后混匀室温静置5 min，12 000 g 4℃离心5 min，将600 μL 上清液移到新的1.5 mL tube 管中，加入200 μL 氯仿震荡混匀静置5 min，12 000 g 4℃离心15 min，将250 μL 上清液转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇静置10 min 12 000 g 4℃离心10 min，弃上清，向沉淀中加入1 mL 的75% 乙醇12 000 g 4℃离心5 min，弃上清保留，沉淀室温干燥后加入20 μL 去离子水（ddH2O）。

逆转录PCR：采用TAKARA Mir-XTMmiRNA First-Strand 试剂将所提总RNA 逆转录为cDNA。逆转录反应体系：mRNA Buffer（2X）5 μL，RNA sample（0.25～8 μg）3.75 μL，mRQ Enzyme 1.25 μL，反应总体积10 μL。反应条件：37℃ 1 h，85℃ 5 min。

定量PCR：qRT-PCR 反应体系：miR-34a 样本组：ddH2O 9 μL，SYBR Advantage qPCR Premix（2X）12.5 μL，ROX Reference Dye（50X）0.5 μL，miRNA-specific primer（10 μmol/L）0.5 μL，mRQ 3'Primer 0.5 μL，cDNA 2.0 μL。反应总体积为25 μL。U6 对照组：ddH2O 9 μL，SYBR Advantage qPCR Premix（2X）12.5 μL，ROX Reference Dye（50X）0.5 μL，U6 Forward Primer（10 μmol/L）0.5 μL，U6 Reverse Primer（10 μmol/L）0.5 μL。反应条件：95℃ 10 s、qRT-PCR 95℃ 5 s、60℃ 20 s 重复40 个循环，95℃ 60 s、55℃ 30 s、95℃ 30 s 重复。采用实时荧光定量PCR SYBR GreenⅠ法检测miR-34a，以U-6 为内参基因，反应结束后软件自动生成荧光定量值动态曲线，并分析显示结果及循环阈值（Ct）。

1.4 分析方法

2-ΔΔCt法分析基因相对表达量，其反映的是实验组基因与对照组的倍数关系，使用U6 作为内参基因。2-ΔΔCt=2-［（实验组目标基因循环数-实验组内参基因循环数）-（对照组目标基因循环数-对照组内参基因循环数）］。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件进行统计分析，采用GraphPad Prism 6 绘制图表。Kolmogorov-Smirnova检验进行正态性分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用t检验，非正态分布的计量资料以中位数和四分位数间距M（P25,P75）表示，组间两两比较采用Mann-WhitneyU检验；计数资料以百分率（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组基本情况统计分析

宫颈癌患者、肺癌患者、结直肠癌患者及健康对照组年龄比较差异无统计学意义（χ2=41.175,P=0.254），见表1。

表1 研究对象的基本情况（n=20）

2.2 各组血清miR-34a 表达水平

经统计学分析发现，与健康对照组相比，宫颈癌组miR-34a 表达上调，差异有统计学意义（40.2 倍，Z=-2.948,P=0.003）；肺癌组miR-34a 表达上升（Z=-1.921,P=0.055），结直肠癌组表达下降，但差异均无统计学意义（Z=-0.407,P=0.684）。进一步比较发现，与结直肠癌组和肺部组相比，宫颈癌组miR-34a 表达明显升高，差异有统计学意义（25.4 倍，P=0.005；93.4 倍，P＜0.001）。见图1、图2、表2。

图1 癌症组与健康对照组血清miR-34a 表达水平比较

图2 癌症组间血清miR-34a 表达水平比较

表2 各组血清miR-34a 表达水平比较

3 讨论

做为miR-34 家族中的一员，miR-34a 在细胞凋亡、细胞增殖、细胞分化及细胞代谢等方面发挥着重要作用。它是抑癌基因p53 的直接作用因子，激活p53 后miR-34a 表达明显上升，进而起到抑制肿瘤的作用［13］。有研究显示，宫颈癌E6 异常表达会抑制p53 表达，进而抑制miR-34a 的表达，促进肿瘤发生发展［14］。多项研究均证实宫颈癌组织及癌细胞中miR-34a 表达降低［15］，但本课题组在之前的工作中，得到了与上述研究相反的结果［12］：课题组通过收集HPV 阳性宫颈癌患者的宫颈细胞样本，采用qRT-PCR 检测了4 种与E6/E7 相关的miRNA（miR-9、miR-21、miR-27b、miR-34a），发现miR-34a 表达与正常对照组和宫颈上皮内瘤样变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）组相比均明显升高（2.987 倍,P=0.002；2.930 倍,0.010）（见图3）。该研究结果提示，miR-34a 在宫颈癌的发生发展中可能通过多种机制发挥作用。目前关于miRNA-34a 在宫颈癌发生早期中的具体机制尚不完全清楚，而其在宫颈癌及癌前病变中的表达争议也增加了研究的必要性，为完善其相关机制提供了可能性［16］。

图3 宫颈脱落细胞miR-34a 在宫颈癌和CIN 时的表达

本研究通过收集宫颈癌患者血清，检测其miR-34a 的表达水平发现，与健康人群相比，宫颈癌患者miR-34a 表达明显升高（40.2 倍,P=0.003），与本课题组之前的研究结论相符，但与大部分研究结论相反。聂小凤等［3］研究表明，宫颈脱落细胞中，miR-34a 在宫颈癌和高级别宫颈上皮内病变中的表达水平显著低于它们在正常宫颈及低级别宫颈上皮内病变中的表达，且miRNA 34a 值随着宫颈病变加重逐渐降低。舒慧敏等［17］研究也表明，miR-34a 在宫颈癌组织中表达降低，且在CIN组织表达也明显降低，并指出miR-34a 表达下降发生在CIN 早期，甚至是在宫颈组织发生形态学改变之前。尽管大多数研究表明miR-34a 在宫颈癌中表达下调，但RIBEIRO 等［18］的研究与本研究相同，他们通过检测患者的宫颈细胞显示，miR-34a 的表达水平与未感染人群相比呈现明显增高，考虑可能因为病毒感染使得细胞修复机制被激活，导致P53 通路激活进而诱导miR-34a 的表达。与舒慧敏等一样，有研究人员认为，miR-34a表达受抑，是宫颈癌发展过程中的一个早期事件。随着疾病发展，一些其它通路可能被激活，参与到疾病的发生发展中导致miR-34a 表达水平的升高［7］。本次研究结果也再次提示，miR-34a 可能通过多种机制在宫颈癌的发生发展中发挥作用。

多项研究显示，除了宫颈癌以外，miR-34a 还在多肿瘤中表达异常，且不同肿瘤miR-34a 的变化趋势并不一致，大多数肿瘤表达下降包括前列腺癌，结直肠癌，乳腺癌等，而肺癌时多研究显示表达上升。卞俊杰等［19］研究表明，与健康对照组相比，非小细胞肺癌患者血清miR-34a 表达升高，并指出miR-34a 的含量与非小细胞肺癌患者的肿瘤负荷强度有关。雒亚蒙等［10］研究表明结肠癌患者的血清miR-34a 基因表达水平较结肠腺瘤性息肉组和健康对照组显著降低。赵春娟等［11］用实时荧光定量PCR 技术检测血清中miR-34a 的基因表达水平前列腺癌，发现前列腺癌患者的血清miR-34a 基因表达水平较前列腺增生组和健康对照组显著降低IORIO 等［20］研究表明miR-34a 在乳腺癌的表达明显低于正常乳腺组织。为了解宫颈癌患者miR-34a 的表达与其它肿瘤是否存在差异，本研究选择了中国人群发病率最高的肺癌和发病率第三的结直肠癌做为疾病对照组进行了研究［21］。研究显示：与肺癌和结直肠癌患者相比，宫颈癌患者血清miR-34a 表达明显升高（84.8 倍，P=0.005；25.4 倍，P＜0.001）。这提示，血清miR-34a 可能做为一个宫颈癌诊断的生物标志，值得进一步研究。本次研究也发现，与健康人群相比，肺癌患者血miR-34a 表达上升，结直肠癌患者血清miR-34a 表达下降，与其它研究的miR-34a 表达变化趋势一致，但差异均不具有统计学意义。这可能与本次研究的标本量较小有关，未来需要增加样本量进行验证。通过分析肺癌及结直肠癌以及宫颈癌患者血清miR-34a 的表达水平也可发现，不同肿瘤其表达变化趋势并不相同，这进一步证实miR-34a 在肿瘤发生发展过程中发挥着非常复杂的作用，可能存在多个靶点。肿瘤不同，病程不同，其激活机制亦不相同。

综上所述，相较与健康人群以及肺癌和结直肠癌患者，宫颈癌患者血清miR-34a 表达明显升高，提示miR-34a 可能做为宫颈癌诊断的生物学指标志来进行深入研究；血清miR-34a 的表达水平和肺癌变化趋势一致，与结直肠癌相反，提示miR-34a 在不同肿瘤中可能通过不同的机制发挥作用，值得进一步探讨。本次研究样本量较小，可能会对结果产生影响，未来将通过大样本量研究，对本次结果进行验证。