近红外荧光分子成像联合光学定量方法筛选口腔鳞状细胞癌转移淋巴结的可行性研究

潘树矿 王育新 孙雨桐 胡梦甜 丁凤 夏成万

近年来,基于吲哚菁绿(indocyanine green,ICG)的近红外荧光成像(near infrared fluorescence,NIF)技术在生物医学领域应用越来越广泛[1-4]。在肿瘤外科领域,该技术已经被应用于肿瘤边界标识,残余肿瘤组织检测及前哨淋巴结定位中[5-6]。目前,Nishio等[7]发现基于panitumumab-IRDye800CW的NIF技术可用于筛选高转移风险的区域淋巴结,提示利用NIF技术术中定位转移淋巴结具有可行性。本研究拟探讨基于ICG的NIF成像联合光学定量方法定位口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)转移淋巴结的可行性,从而为该技术的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 ICG注射及NIF成像设备

ICG(丹东医创制药有限公司);荧光成像设备为手持NIF探测仪(MaYa 2000 Pro,Ocean Optics,Dunedin,Florida,USA)的NIF成像设备(Real-IGS,南京诺源医疗器械有限公司)。该设备激发光谱为785 nm,接受830 nm ICG发射光,显示屏可同时显示白光图像、融合图像、荧光图像和热图4 个窗口。

1.2 临床试验

1.2.1 纳入与排除标准 本研究经南京大学医学院附属口腔医院伦理委员会批准(批号:2017NL-001),所有患者均已签署知情同意书,所有患者的具体治疗方案均经过多学科综合讨论后制订。纳入标准为:(1)经病理活检明确诊断为OSCC;(2)影像学检查患者TNM分期为cT1-4N0M0,其中TNM分期标准采用AJCC第7版标准。排除标准为:(1)曾接受头颈部放化疗;(2)对ICG、碘制剂过敏;(3)孕妇或待孕患者;(4)严重肝肾功能障碍。

1.2.2 ICG注射和NIF成像 手术前12 h,按照0.75 mg/kg的配比,将ICG充分溶于30 mL灭菌注射用水中,利用静脉泵30 min缓慢注射入肘静脉中。术中患者经过常规麻醉和铺巾后,翻开颈阔肌和胸锁乳突肌,暴露出颈部淋巴组织,使用NIF成像设备对颈部淋巴组织区域进行实时NIF成像,使用手持NIF探测仪对荧光显影淋巴结进行荧光强度定量检测送其至病理科行快速病理检查,随后按既定手术方案行颈部淋巴结清扫术和原发灶切除,分选淋巴结,定量检测荧光强度后送至病理科行常规病理检查。记录所有淋巴结的位置、荧光强度和转移状态。

1.2.3 病理学检查 对于术中快速冰冻切片检查,淋巴结组织首先包埋于OCT包埋剂中,使用冰冻切片机切取10 μm厚切片,按冰冻切片快速染色常规步骤进行染色。对于常规病理切片检查,将所有淋巴结组织固定于福尔马林溶液中过夜,随后按石蜡标本制作常规流程进行石蜡包埋,切取4 μm厚切片,分别按标准流程行HE染色和CK5/6免疫组化染色,最后在光镜下由两位高年资病理科专家判断淋巴结是否存在肿瘤细胞。

1.3 统计学分析

所有数据均使用SPSS统计软件(Version 23.0,IBM,USA)和GraphPad Prism软件(Version 6.0,GraphPad Software,USA)。测量数据均表达为平均值±标准差。对于转移/非转移淋巴结的荧光强度使用双侧t检验比较;淋巴结的荧光强度使用双侧t检验比较;通过受试者操作特征曲线分析(receiver operating characteristic curve,ROC curve)计算静脉注射ICG鉴别OSCC转移淋巴结的敏感性和特异性,阈值根据Youden指数确定,似然比(likelihood ratio,LR)定义为:LR=敏感性/(1-特异性)。不同患者的淋巴结ICG荧光信号的个体差异使用one way ANOVA检验。P≤0.05认为具有统计学意义,用“*”表示。

2 结 果

2.1 患者资料

经过术前病理活检明确诊断为OSCC患者共20 例,平均年龄为64.7 岁(50～77 岁),其中男性患者11 例,女性患者9 例。8 例(40%)患者肿瘤位于舌体,8 例(40%)患者肿瘤位于颊部,2 例(10%)患者肿瘤位于硬腭,1 例(5%)患者肿瘤位于下唇,1 例(5%)患者肿瘤位于口咽;19 例(95%)患者接受了单侧颈部淋巴结清扫术,1 例(5%)患者接受了双侧颈部淋巴结清扫术。经过常规病理学检查,有7 例患者(35%)的12 枚淋巴结被诊断为转移淋巴结(患者情况具体见表1)。

表1 OSCC患者临床资料

2.2 基于静脉注射ICG的NIF成像评估OSCC区域淋巴结状态

为了评估基于静脉注射ICG的NIF成像评估OSCC区域淋巴结状态的特异度和灵敏度,本研究对颈部淋巴结进行了在体和离体NIF成像。其中,在体成像中,13 例(65%)患者的27 枚淋巴结出现了荧光显影(图1),经过术中快速病理检查后,6 例(46.2%)患者的8 枚(29.6%)淋巴结被诊断为转移淋巴结。颈部淋巴结清扫完成后,本研究按照颈部淋巴结分区对淋巴结进行了分选,总共497 枚淋巴结被分选出来,其中38 枚(7.6%)淋巴结位于Ⅰa区,77 枚(15.5%)淋巴结位于Ⅰb区,144 枚(29.0%)淋巴结位于Ⅱ区,157 枚(31.6%)淋巴结位于Ⅲ区,81 枚(16.3%)淋巴结位于Ⅳ区。经过病理学检查后,有12 枚(2.4%)淋巴结被诊断为转移淋巴结,其中8 枚(66.7%)淋巴结为荧光显影淋巴结,4 枚(33.3%)淋巴结术中无荧光显影。以单个淋巴结的转移状态为统计单位,特异度和灵敏度分别为96.1%和66.7%。阳性预测率和阴性预测率分别为29.6%和99.1%,准确率为95.4%;以患者整体淋巴结转移情况为统计单位,对照病理,基于静脉注射ICG的NIF成像技术评估OSCC区域淋巴结转移状态的准确度达到了95%。

图1 静脉注射ICG后OSCC患者颈部淋巴结NIR术中成像情况

2.3 离体淋巴结荧光强度定量分析

所有淋巴结按照颈部淋巴结分区分选后,均用手持式NIF检测仪进行荧光定量测量。转移淋巴结的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)为96.9±37.7(范围:37-136),明显高于非转移淋巴结的平均荧光强度29.5±16.8(范围:1-108)(P<0.001)(图2A)。

图2 静脉注射ICG后OSCC颈部淋巴结荧光信号强度与淋巴结转移的关系

为评估通过测量离体淋巴结荧光强度判断淋巴结状态的可行性,本研究进一步分析了淋巴结转移状态与淋巴结荧光强度之间的关系。对于接受静脉注射ICG,以荧光强度为81.5作为区分转移/非转移淋巴结诊断界限时,诊断价值最高,灵敏度和特异度分别为75%和98.76%(LR=3.951),阳性预测率和阴性预测率分别为60%和99.4%。ROC曲线结果显示,静脉注射ICG,曲线下面积达0.95(95%置信区间为0.89-0.99),提示静脉注射ICG,利用荧光强度定量分析判断淋巴结状态具有很好的可行性(图2B)。

考虑到患者个体差异对区域淋巴结的荧光强度的影响,使用单一的荧光强度阈值来筛选可疑淋巴结可能不适用于每个患者。针对单个患者,应该转化思路,分析经过静脉注射ICG后,准确判断OSCC患者颈部区域淋巴结是否存在转移所需病理检测的最小淋巴结数,来提高后续病理检测的针对性。因此本研究首先对每个患者所有淋巴结按照荧光强度进行排序。分析发现,对于接受静脉注射ICG的患者,只需通过病理检测荧光强度排名前6的淋巴结即可准确判断颈部淋巴结是否转移(特异度和灵敏度分别为76.2%和100%)。进一步分析淋巴结病理检测数目对NIF成像判断OSCC颈部淋巴结转移状态的影响,结果显示对于静脉注射ICG组,最佳的淋巴结检测数目为6枚,特异度和灵敏度分别为78%和100%(图3)。

图3 OSCC 颈部淋巴结转移状态的影响

3 讨 论

OSCC是头颈部常见恶性肿瘤之一。根据Global Cancer Statistics 最新数据显示,全球每年新发OSCC 354 864 例,死亡177 384 例[8]。国内的最新统计数据显示,OSCC的每年新发人数达到了4.6万人,死亡人数达到了2.1 万人[9]。手术治疗是OSCC患者首选治疗方法,但其5年生存率始终徘徊在60%左右。颈部区域复发是导致OSCC治疗失败的重要原因之一。为此,临床医生多行选择性颈淋巴清扫术避免区域复发。然而,回顾OSCC患者的术后病理资料,只有30%的患者存在颈部淋巴结转移[10-11],这意味着剩余的70%患者接受了不必要的颈淋巴结清扫术,并带来了一系列的并发症,如颈部皮肤麻木,颈肩综合症等[12]。

目前,术前多应用影像学方法评估OSCC患者是否存在转移淋巴结,如 CT、MR 及 PET-CT 等,为术者评估手术难度及淋巴结清扫范围,但是判断淋巴结转移准确率较低,对于术中实时淋巴结清扫指导意义有限[13-14]。术中确定淋巴结清扫范围的方法主要依靠术者经验、存在主观性强且准确性低的不足;前哨淋巴结活检术(sentinel lymph node biopsy,SLNB)是另外一种用于术中评估淋巴结是否转移的方法[15]。目前前哨淋巴结活检术在乳腺癌、恶性黑色素瘤、头颈癌等恶性肿瘤得到广泛应用[16-18]。然而传统的前哨淋巴结活检示踪剂如亚甲蓝、核素等在定位前哨淋巴结仍有其局限性,如低灵敏度/特异度,放射性污染,透过效应现象等干扰了其进一步发展[16,19-23]。此外前哨淋巴结活检依然依赖于病理学检查,在避免微小转移灶的漏诊方面依然没有得到改进[19]。术中病理是评价淋巴结病理状态的金标准,但受限于病理取材切片,微小转移灶同样容易被漏诊。全样本连续性切片是目前避免淋巴结中转移灶漏诊的最有效办法,但由于该技术工作量大,价格昂贵,目前尚不具有应用于临床的可能[20]。

近红外影像手术导航是近十年来新发展的前沿技术,也是目前精准医疗研究热点之一[21]。该技术的出现为术中肿瘤定位、边缘判定探测提供了一种实时、准确的检测工具。多位研究者也发现基于瘤周注射ICG的NIF技术相比于传统的亚甲蓝、核素等示踪剂可以提高前哨淋巴结的检出率[22-23]。但是考虑到瘤周注射ICG会影响原发灶解剖结构的识别,干扰原发灶的切除,且课题组前期研究发现了通过静脉注射0.75 mg/kg ICG后12 h可以清晰显示OSCC原发灶范围,指导原发灶的切除[5],且考虑到静脉注射ICG后,ICG可能会通过两种方式蓄积于转移淋巴结中:(1)ICG首先通过EPR效应蓄积于OSCC原发灶中,随后通过淋巴引流蓄积于转移可能性大的前哨淋巴结;(2)ICG通过EPR效应直接蓄积于转移淋巴结中的肿瘤组织内;从而使转移淋巴结相较于正常淋巴结蓄积更多的ICG。因此本研究尝试观察了同样的静脉ICG给药方式可否同样指导术中筛选OSCC转移淋巴结。结果显示,基于静脉注射ICG的NIF技术同样可以辅助鉴别OSCC区域淋巴结状态,其灵敏度和特异度分别为66.7%和96.1%,准确度达到95.4,结合术中快速冰冻切片检查,有95%(19/20)的OSCC患者区域淋巴结状态被准确判断。此外,对于离体的淋巴结,NIF荧光定量检测分析鉴别的灵敏度和特异度达到了75%和98.76%。这与Digonnet等[24]通过静脉注射HSA∶ICG®筛选转移淋巴结的灵敏度和特异度达到了76.5%和76.7%,Nishio等[7]通过静脉注射Panitumumab-IRDye800CW筛选转移淋巴结的灵敏度和特异度达到了84.6%和94%相似,提示了基于ICG的NIF成像技术用于术中筛选OSCC转移淋巴结同样具有临床应用前景。

综上所述,基于静脉注射ICG的NIF成像技术结合光学定量分析可以有效的实现术中初筛OSCC患者可疑的转移淋巴结,并通过术中快速病理进一步在术中为颈清范围的制定提供更准确的依据。但是目前本研究仅纳入患者20 例,其推广应用仍需进一步的大样本临床研究验证,此外由于ICG作为近红外一区荧光材料,荧光穿透深度仍有限,尚无法实现对颈部深层区域淋巴结的成像,仍有可能造成显影淋巴结的漏检,未来这方面可寄希望于穿透深度更强的近红外二区材料。