超声空化用于牙刷杀菌的机制研究

李晨 陈尹尹 胡璨 杨增涛

随着生活水平的提高,人们的健康意识不断加强,口腔卫生问题更加受到重视。不良的口腔卫生习惯会导致口腔内细菌的累积,进而引起牙菌斑、牙龈炎、牙龈出血、口臭等口腔疾病的发生,严重危害人们的身心健康[1]。为了减少口腔疾病的发生,人们清洁口腔的方式越来越多样,比如电动牙刷、冲牙器、漱口水等。但市场上的这些产品大多数只能达到口腔基础清洁、减少异味[2-3]的效果,几乎没有杀菌功能,且大多数漱口水副作用很多,不能长期使用[4]。因此,需要一种具有杀菌效果、副作用小的口腔清洁方法。

超声波是一种频率高于20 kHz的机械波,其作用于介质时能引起一些特殊效应,主要有机械效应、热效应、空化效应以及理化效应[5]。一般认为,超声波所具有的杀菌效力主要是由其产生的空化作用引起的[6]。当超声波作用于液体介质时,超声诱导的空化会在液体中产生微小气泡,气泡最终变得不稳定并坍塌,在微观尺度上释放高温高压。在超声波的压缩阶段,瞬态空化的剧烈崩塌产生了物理效应,如冲击波和由于OH自由基引起的化学效应。据相关研究表明,超声波灭活微生物的机制进一步解释为在超声波照射期间产生的物理效应和(或)化学效应[7]。

基于超声波的生物效应,相关人员开始将超声波应用到牙刷上,以达到更好的口腔杀菌效果[8]。国内外实验和研究成果表明超声波牙刷不仅能像普通电动牙刷一样去除牙石牙垢,还具有去除顽固牙垢牙菌斑[9-10]、祛除口臭、杀灭细菌[11]、抑制牙周炎症[12]和牙龈出血[13],防止牙龈萎缩等优点。然而,这些超声波牙刷在用于口腔杀菌中的作用机制尚不明确,限制了超声波类口腔杀菌产品的进一步发展。

本研究设计了两种频率的超声波牙刷,通过检测超声波在液体中产生H2O2的量,来评估其化学效应的强弱,并用大肠杆菌悬液评估其杀菌效率。

1 超声波牙刷设计

1.1 超声参数选择

声化学和物理效应在很大程度上取决于适当选择超声参数,如强度和频率[14]。低频超声波在处理细菌悬浮液时主要引起物理效应,如机械效应和热效应,而高频超声波主要引起化学效应[15]。频率在100～1 000 kHz之间的超声通常被认为是最具有化学活性的区域[16-17],可最大限度地产生自由基并对细菌造成氧化损伤。本研究设计的超声波牙刷主要利用超声波空化作用产生的OH自由基引起的化学效应来达到杀菌的效果。该过程产生OH自由基可以攻击细胞壁膜[18],这些自由基重组成过氧化氢也有助于杀灭口腔中的细菌[19]。因此,本文设计了1 MHz和2 MHz两种频率超声波牙刷,对其口腔杀菌作用机制进行探究。

1.2 实验装置

超声波牙刷装置组件如图1A,刷头内置一个压电换能器,由电源部分驱动电路激励产生超声波,发射能量,其清洁牙齿工作原理图如图1B。超声牙刷头发射出超声波,通过口腔内的水、牙膏等液体引起空化效应,产生大量微小气泡,在牙齿周围气泡瞬间爆裂产生高压冲击牙齿,全面清洁口腔内各个部位;超声空化的化学效应直接杀死口腔细菌,减少牙菌斑产生,清除口腔异味。

图1 装置示意图

2 化学效应检测

本实验通过超声波牙刷处理大肠杆菌悬液后,检测该过程H2O2的产量来反映超声作用下化学效应的强弱,并对比两种频率超声波牙刷作用下的差异,分析其作用机制。

碘化物法通常用于量化超声波处理过程中产生的H2O2浓度,碘离子被过氧化氢氧化形成分子碘(方程式1),分子碘能与过量的碘离子反应生成I-3复合物(方程式2),可在353 nm处通过紫外线测量进行检测。

过氧化氢与碘化钾反应过程:

H2O2+2I-→I2+2OH-

(1)

在测量吸光度之前,将1 mL经超声处理的样品转移到2 mL碘化钾试剂中,每次取100 μL混合溶液到孔板里,用酶标仪(TECAN,INFINITE M PLEX,德国)测量吸光度。H2O2的浓度c可以通过以下公式计算:

其中,A是353 nm处的吸光度值,ε是摩尔吸光系数(26 400 M-1cm-1),l是孔径长度,n是混合溶液与经超声处理样品的容积之比。

3 杀菌效率的评估

3.1 大肠杆菌悬液的制备

用无菌吸管挑取在Luria-Bertani(LB)营养琼脂固体培养基(重庆奥怡生物技术有限公司)中培养好的大肠杆菌单菌落,在无菌操作下,将菌种和吸管一并放入盛有配制好的LB肉汤液体培养基的三角瓶中,再将三角瓶放进恒温(37 ℃)培养振荡器里进行摇菌处理16 h,即可获得大肠杆菌的菌悬液。

3.2 超声波牙刷对大肠杆菌的杀灭效率计算

图2为使用超声波牙刷处理大肠杆菌悬液。用频率为1 MHz和2 MHz的超声波牙刷分别处理配制好的大肠杆菌悬液,每个实验组处理1、2、3、4、5 min,将处理的菌悬液稀释104倍后取100 μL涂布在营养琼脂平板上,每个分钟的实验组各涂布3 个平板。含有相同浓度的细菌但未经超声处理的悬液作为对照。然后,将营养琼脂平板在37 ℃下培养48 h,并用平板菌落计数法测定活菌浓度[20],以获得活菌浓度的变化。同时,对不同频率下杀菌效率进行比较。

图2 超声波牙刷处理大肠杆菌悬液

大肠杆菌灭活率的计算公式如下:

式中:R是大肠杆菌的灭活率,N是杀菌t时刻之后的培养基菌落数(CFU/mL),N0是未经过杀菌处理的培养基菌落数。

4 实验结果与讨论

4.1 不同频率下声功率的测量

两种频率的超声波牙刷应尽可能在相同的声功率下工作,通过使用声功率计(Ohmic,UPM-DT-1AV,美国)测得1 MHz和2 MHz的声功率数值分别为0.26 W和0.25 W。因此,两种装置输出的声功率差别很小。

4.2 不同频率超声波的化学效应的强弱

已知超声波处理过程中由OH自由基及其引起的化学效应产生H2O2可使微生物灭活,化学效应的强弱程度可由H2O2产量间接量化。不同频率下H2O2的产量随超声波处理后的时间而变化,因此研究采样时间对细菌计数的影响非常重要。

本研究的取样时间对应于超声波处理后的时间,此时将超声波处理后的大肠杆菌悬液在营养琼脂平板上培养,以确定存活率。在不同超声频率和超声时间条件下对大肠杆菌进行了超声处理的初步实验,非超声波处理的大肠杆菌悬液用作对照,并抽取等分试样在琼脂平板上生长,便于细菌计数。图3显示了采样实验结果,随着超声处理时间的延长,H2O2的产量增加,且2 MHz超声处理的H2O2产量高于1 MHz。实验结果表明,在高频情况下,超声波频率越高,其空化所产生的化学效应越强,这与先前报道的结果相吻合[14]。

4.3 杀菌效率的评估

图4为未经超声处理和超声处理后培养48 h的大肠杆菌菌落形成情况,从图中可以看出在3 min时菌落数量开始明显减少,4、5 min时杀灭了绝大部分细菌。图5为两种不同频率下超声波牙刷对辐照时间的杀菌效率曲线,从图中可以看出,随着超声处理时间的延长,超声杀菌效率增高,但随着处理时间的延长,最终杀菌效率趋于一个饱和值,在实验误差范围内,处理5 min后,两种频率的超声波牙刷杀菌效率均高于90%;此外,在相同作用时间下,2 MHz的超声波牙刷杀菌效率明显高于1 MHz的超声波牙刷,这与Koda等[7]观察到的实验结果相符。

图4 培养48 h后菌落形成情况

图5 不同频率超声波牙刷杀菌率

5 结 论

通过利用自行设计的两种频率的超声波牙刷(1 MHz和2 MHz)对大肠杆菌悬液处理过程中H2O2产量的测定,反映其化学效应的强弱,评估其杀菌效率,并对比两种频率的超声波处理后的差异。实验结果显示,在兆赫兹以上频率超声波处理下,频率越高产生的H2O2量越多,即化学效应越强,杀菌效率也越高。因此,超声波牙刷用于口腔杀菌时,主要由OH自由基引起的化学效应及伴随产生的H2O2起主要作用。本研究可为超声波类口腔杀菌产品的设计开发提供参考。