膝关节骨关节炎患者 COG5 基因 rs3815148 和rs3757713 单核苷酸多态性的研究

张德俭 乔浩然 闵红巍 赵立希

膝关节骨关节炎 (knee osteoarthritis，KOA) 是一种高发于老年人群的常见病。KOA 将破坏关节软骨完整性、导致关节变形、出现软骨下骨板病变和骨质增生，严重影响患者的生活质量。KOA 的发病因素有很多包括年龄、外伤、肥胖和遗传等，其中遗传因素占 20%[1]。全基因组关联分析 (genome wide association study，GWAS) 提示基因多态性与 KOA的易感性有关。在对北美白种人群 KOA 的 GWAS分析中发现，rs4867568、rs143383、rs835487 和rs8044769 多态性与 KOA 的易感性有关[2]。除此之外，也有很多文献报道了中国汉族人群基因多态性与 KOA 易感性的关系，比如 FGF18 基因 rs3884606多态性[3]和白介素-6 (interleukin-6，IL-6) 基因启动子区 -174G / C 基因多态性[4]与 KOA 相关。

对染色体 7q22 区段的研究提示 COG5 基因多态性与 KOA 有关，GWAS 研究发现荷兰白种人群COG5 基因的 rs3815148 和 rs3757713 多态性与 KOA的易感性相关[5]，且 Meta 分析也显示 COG5 基因与 KOA 的易感性有关[6]。Gao 等[7]将 GWAS 分析与通路分析相结合，找到了包括 COG5 基因在内的 3 个 KOA 差异表达基因。之前对于 rs3815148 和rs3757713 这两个单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism，SNP) 与 KOA 的关联性研究主要集中于白种人，对于中国人群的相关性鲜见报道。因此，本研究主要探讨 COG5 基因 rs3815148 和rs3757713 多态性与中国北方汉族人群 KOA 的关联性，分析其与 KOA 发生发展的关系。

资料与方法

一、纳入标准与排除标准

1.纳入标准：(1) KOA 组纳入标准：① 汉族；② 年龄 50～80 岁者；③ 符合 KOA 诊断标准者；④自愿参与本研究并签署知情同意书者。(2) 对照组纳入标准：① 汉族；② 年龄 50～80 岁者；③ 无既往膝关节炎病史者；④ 自愿参与本研究并签署知情同意书者。

2.排除标准：(1) 非汉族；(2) 年龄 ＞ 80 岁或 ＜ 50 岁者；(3) 不符合 KOA 的诊断标准者；(4)继发性 KOA 者；(5) 炎症性膝关节炎者；(6) 有严重基本疾病的患者。

二、一般资料

根据纳入标准与排除标准，收集 2017 年1月至 2018 年 12 月在中国康复研究中心北京博爱医院和首都医科大学附属北京朝阳医院就诊的原发性KOA 患者 96例为 KOA 组，选择年龄相当的 118例门诊健康志愿者作为对照组，采用美国风湿病协会的 KOA 诊断标准为诊断依据。所有研究对象均记录其年龄和体质量指数 (body mass index，BMI)，用2 ml 乙二胺四乙酸 (ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA) 抗凝管收集全血，并分装保存于 -80 ℃ 冰箱。本研究经过中国康复研究中心北京博爱医院伦理委员会批准 (No.2017-075-1)。

三、DNA 提取与基因分型

将整理好的血液样本分批在冰袋上解冻，根据QIAamp DNA Mini Kit (凯杰公司) 操作说明书进行基因组 DNA 提取，1.5 μl 去离子水从离心柱上洗脱DNA，DanoDrop 检测 DNA 浓度，琼脂糖凝胶电泳检测基因组完整性，提取后的基因组 DNA 保存于 4 ℃冰箱中。取保存于 4 ℃ 冰箱中的 DNA 为模板进行聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR)，上游引物序列为 5’-TCTGGAGGTTCAAGGTGGAG-3’，下游引物为 5’-AAGGTCTTCTGCTTTAGGGA-3’，反应条件为 94 ℃ 5 min 热启动，94 ℃ 45 s、57 ℃45 s、72 ℃ 45 s 循环 35 次，72 ℃ 5 min 延伸，4 ℃保存。将 PCR 扩增后的 COG5 基因片段进行一代测序 (上海美吉生物医药科技有限公司)，从测序结果中分析 SNP 的等位基因以及基因型。

四、统计学处理

采用 PASW Statistics 18.0 统计软件对年龄和BMI 进行t检验。SHEsis 在线程序 (http://analysis.bio-x.cn) 分析 rs3815148 和 rs3757713 的哈迪 - 温伯格平衡 (Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)、等位基因频率、基因型频率以及单体型；P＜ 0.05 为差异有统计学意义，P＜ 0.01 为差异有显著统计学意义。

结 果

一、一般资料比较

两组年龄差异无统计学意义 (P＞ 0.05)；KOA组中女性患者较多，差异有显著统计学意义 (P＜0.0001)；两组 BMI 差异有显著统计学意义 (P＜0.0001)。说明在年龄相当的情况下，女性更容易患病而且 BMI 指数越高罹患 KOA 的风险越大 (表1)。

表1 两组一般资料比较Tab.1 General clinical data were compared between the two groups

二、SNP 多态性分析

对 rs3815148 和 rs3757713 进行 HWE 分析结果显示，这两个位点在 KOA 组和对照组中均符合HWE (表2)。说明这两个 SNP 位点在群体中达到了遗传平衡的状态。

表2 HWE 分析Tab.2 Hardy-Weinberg equilibrium

对 rs3815148 多态性结果的分析显示 (表3)，KOA 组和对照组中等位基因分布差异有统计学意义(P= 0.033) ，基因型分布差异也有统计学意义 (P=0.023)。其中 G 等位基因为危险因子，在显性模型下 TT 基因型起保护作用 (P= 0.003) (表3)。

表3 rs3815148 和 rs3757713 多态性分布分析Tab.3 Results of the genotype frequency analysis of rs3815148 and rs3757713

对 rs3757713 多态性分析显示，KOA 组和对照组中等位基因分布差异有统计学意义 (P= 0.022)，基因型分布差异也有统计学意义 (P= 0.015)。其中G 等位基因为危险因子，在显性模型下 TT 基因型起保护作用 (P= 0.003) (表3)。

对 rs3815148 和 rs3757713 单体型分析结果显示，KOA 组和对照组的单体型分布差异有统计学意义 (P= 0.022)，T / T 单体型数在对照组中出现频率较 KOA 组高，提示 T / T 单体型可能是 KOA 的一个保护因素 (表4)。

表4 rs3815148 和 rs3757713 单体型分析Tab.4 Results of the genotype analysis of rs3815148 and rs3757713

讨 论

膝关节作为下肢最重要的承重关节之一，非常容易出现损伤，此病主要表现为反复发作的膝关节疼痛、晨起僵硬、活动时发出骨摩擦音等[8]。基因多态性是指在同一基因位点可存在两种以上的基因型，其中 SNP 指由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性，SNP 也是 KOA 易感的一个重要因素[9]。

全基因组关联分析显示荷兰白种人的 7q22 区与膝关节骨关节易感性有关，其中 rs3815148 多态性位点的 G 等位基因能增加 1.14 倍 KOA 的发病风险[5]。但是 rs3815148 多态性与 KOA 的关联还处于争议中，对英国人群的 rs3815148 分析显示该 SNP 与骨关节炎没有显著性关联[10]，在另一项针对年轻人群KOA 的基因多态性分析中也显示 rs3815148 与 KOA无相关性[11]。在 ALFA 等位基因频率数据库中显示rs3815148 的 G 等位基因在东亚人群中的分布频率为 0.076，在本研究中对照组的 G 等位基因频率为0.093，KOA 组中为 0.161，统计结果显示 rs3815148的 G 等位基因在 KOA 组和对照组中差异有统计学意义 (χ2= 4.544，df= 1，P= 0.033)，提示 rs3815148的 G 等位基因可能是 KOA 的一个风险因子，但是TT 基因型可能是 KOA 的一个保护因素 (χ2= 7.511，df= 2，P= 0.023)。此外，研究表明 rs3757713，同样是 KOA 的风险因素[5]，而且芬兰女性中 rs3757713 G 等位基因是手骨关节炎的危险因素[12]。在 ALFA等位基因频率数据库中显示 rs3757713 的 G 等位基因在东亚人群中的分布频率为 0.1，在本研究中对照组的 G 等位基因频率为 0.085，KOA 组中的频率为 0.156，统计结果显示 rs3815148 的 G 等位基因在KOA 组和对照组中差异有统计学意义 (χ2= 5.246，df= 1，P= 0.022)，提示 rs3757713 的 G 等位基因可能是 KOA 的一个风险因子，而 TT 基因型可能是KOA 的保护因素 (χ2= 8.427，df= 2，P= 0.015)。由于 rs3757713 与 rs3815148 处于连锁不平衡状态，因此本研究也分析了这两个 SNP 单体型的分布，结果提示 TT 单体型可能是 KOA 的保护因素 (χ2=5.193，df= 3，P= 0.022)。

人类 COG5 基因全长约 363.6 kb，包括 23 个外显子，COG5 蛋白是拴系因子 COG 复合体的一个亚基，该复合体参与蛋白质的分选和糖基化过程，并具有维持高尔基体完整性的作用[13]。N-聚糖可以和半乳糖凝集素结合，导致 IL-1β 等促炎因子的分泌，从而引起滑膜的病变并进一步引发骨关节[14]。COG5基因的变异可导致先天性糖基化障碍，在相关病例报道中 COG5 基因突变导致先天性糖基化障碍可呈现的症状包括姿势不稳定、行走困难、右手手指尺骨偏斜等症状[15]。此外，在对莱伯氏先天性黑蒙症中的研究发现 COG5 基因的突变不仅能引起视网膜退化，还会导致小头畸形和骨骼发育不良[16]。在对幼年特发性关节炎易感位点的 GWAS 相关 Meta 分析中显示 COG5 基因顺式表达数量性状位点的 SNPs 与该疾病相关[17]。在不宁腿综合征的 GWAS 分析中显示相关易感基因位于基因组 7q21 和 7q22 区，且显著相关的基因包括 COG5 等 6 个基因[18]。这些研究提示 COG5 基因与骨骼、关节等发育和功能相关。

本研究还存在一定的局限性。首先，本研究的样本量仍然较少，包括患者和健康对照组；其次，本研究中所有正常对照组均为无明显骨关节炎症状，但也不能排除少数健康者处于无症状状态，或者影像学检查为发现轻度骨关节炎而被纳入健康对照组中。

总之，目前对骨关节炎的治疗是有限的，不足以预防疾病的发生和发展。骨关节炎患者的遗传学研究可以阐明导致特定疾病表现的分子机制，包括关节损伤，疼痛和慢性疼痛，并为治疗探索提供新的思考。