破骨细胞在脂多糖介导骨丢失小鼠中的作用及机制研究

曹祚 罗世城 张攻孜 伍盛鑫 陈浩彬 张立海

骨质疏松症 (osteoporosis) 是由于多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病[1-3]。骨质疏松已成为困扰老年人群的主要疾病，其发病率已经紧随糖尿病、阿尔茨海默病，跃居老年病第三位[4]。原发性骨质疏松症诊疗指南指出炎性疾病也是骨丢失的重要危险因素，包括炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)、系统性肥大细胞增多症、自身免疫性疾病 [ 如类风湿关节炎 (rheumatoid arthritis，RA)、系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus，SLE) ]等[5]。Abu-Amer 等[6]指出脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS) 通常被认为是溶骨性病变发病机制的核心，但是这种物质促进骨吸收的机制尚不清楚。LPS 作为常见的内毒素起到关键作用，在体内可以通过细胞信号转导系统激活单核巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞等，合成和释放多种细胞因子和炎性介质，进而引起机体一系列的反应。破骨细胞是骨吸收的主要功能细胞，是由骨髓中的髓系祖细胞分化而成的单核巨噬细胞相互融合所形成的多核巨细胞，在骨发育、生长、修复、重建中具有重要的作用[7]，破骨细胞过度形成是炎症性骨破坏的重要病理特征之一，且与 LPS 介导的炎性骨丢失密切相关[8]。研究表明，LPS 能刺激 CD4+T 细胞分化[9]，同时 CD4+T 细胞刺激诱导破骨细胞[10]，尽管有研究表明 LPS 能刺激破骨细胞生成[11]及 T 细胞分化，但发挥作用的 T 细胞亚群及途径尚未明确。为了进一步探讨 LPS 刺激 T 细胞的分化以及其对诱导破骨细胞分化增殖的作用机制，本实验采用 LPS介导炎性骨丢失模型提取骨髓血中 T 细胞进行流式细胞术以及细胞共混培养的方法来探索发挥作用的T 细胞亚群及其机制。

材料与方法

一、实验动物

雌性 C57bl / 6 小鼠 10 只 (购于解放军总医院动物医学实验中心)，8 周龄，体重 17.8～18.8 g，平均 17.3 g。本实验动物使用许可证号：SYXK (军)2017-2019。本研究已获解放军总医院医学伦理委员会批准 (2019-X15-44)。

二、主要试剂、材料和仪器

采用成骨细胞和单核细胞以及 RAW264.7 细胞诱导形成破骨细胞及配套专用培养基 (武汉普诺赛生命科技有限公司)，PerCP / Cyanine5.5 anti-mouse CD3 (Biolegend)，FITC anti-mouse CD4 (Biolegend)，PE anti-mouse IL-17A (Biolegend)，APC anti-mouse TNF-α (Biolegend)，小鼠白介素 17A (interleukin-17A，IL-17A) 酶联免疫吸附测定 (enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 试剂盒 (武汉基因美科技有限公司)，抗酒石酸酸性磷酸酶 (tartaric acidic phosphatase，TRAP) 试剂盒 (Sigma)，4% 多聚甲醛(Coolaber)，涡旋振荡仪 (海门市其林贝尔仪器制造有限公司)，分光光度计 (Therno scientific)，离心机 (Eppendorf)，酶标仪 (北京凯奥公司)，激光共聚焦显微镜 (OLYMPUS FV1000-1X81)，micro-CT 设备 (SIEMENS)，影像数据分析软件 Inveon Research Workplace (SIEMENS)，脱水机 (武汉俊杰电子有限公司)，包埋机 (武汉俊杰电子有限公司)，石蜡切片机 (Leica)，冻台 (武汉俊杰电子有限公司)，组织摊片机 (浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)，烤片机 (常州国华电器有限公司)，烤箱 [ 邦西仪器科技 (上海) 有限公司 ]，倒置显微镜 (Nikon)，NikonCi-S 成像系统 (Nikon)。

三、动物及细胞分组

动物分组：将 10 只雌性 C57bl / 6 小鼠编号后完全随机分为两组，LPS 组和对照组。LPS 组按2.5 mg / kg 隔天腹腔注射，对照组注射等量生理盐水，共计 28 天。

细胞分组：将 Th17 TNF-α+细胞、CD4+IL-17-细胞分离出来，分别与成骨细胞、单核细胞体系及RAW264.7 细胞系进行共混培养。

四、micro-CT 影像扫描及数据分析

小鼠安乐死后取右侧股骨，经 4% 多聚甲醛固定，隔夜后去除多余软组织，将股骨固定于扫描管内，调整三维位置，使用 micro-CT 进行扫描 (扫描条件：60 kV、500 μA，分辨率为 9.08)，扫描数据以 DICOM 格式存储。将扫描的影像数据导入影像分析软件，分析股骨远端距离干骺端 0.5～1.0 mm 处，主要包括骨密度 (bone mineral density，BMD) 以及骨微观结构参数中骨体积分数 (bone volume fraction，BV / TV)、骨小梁数目 (trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度 (trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁空隙 (trabecular separation，Tb.Sp)。

五、小鼠股骨干骺端 TRAP 染色

将固定好的股骨放在乙二胺四乙酸 (ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA) 脱钙试剂里，密封，脱色摇床脱钙。把脱钙后的股骨放入包埋模中，将股骨梯度乙醇脱水，透明，浸蜡；组织切面向下包埋，待蜡块冷却后从模具中取出，修块。待切片、烤片等工作完成后，按下列操作进行 TRAP染色：二甲苯 10 min；二甲苯 10 min；二甲苯∶无水乙醇 = 1∶1，2 min；无水乙醇 5 min；90% 乙醇2 min；70% 乙醇 2 min；水洗 2 min；自然晾干，TRAP 固定液 4° 固定 3 min；水洗，晾干；浸入TRAP 孵育液，置于 37 ℃ 温箱，浸染 60 min，水洗；复染：甲基绿染色液 3 min。水洗，晾干，中性树胶封固。染色完成后切片显微镜拍照并对破骨细胞计数。骨组织中的破骨细胞呈紫红色。

六、流式细胞术

取小鼠骨髓血，加入含有 5% 胎牛血清 (fetal bovine serum，FBS) 和双抗的 1640 培养基，调节细胞浓度为 107个 / ml 备用。将检测管加入细胞悬液100 μl，加入荧光标记抗体，混匀后常温避光反应20 min；加入 0.5 ml 固定液，常温避光放置 20 min；PBS 洗涤后加入合适量的细胞因子荧光标记抗体混合均匀后，室温避光反应 30 min；冲悬细胞，上流式细胞仪检测并分析。

七、细胞共混培养

将 Th17 TNF-α+细胞以及 CD4+IL-17-细胞分别与成骨细胞 (osteoblasts) + 单核细胞 (monocytes)和 RAW264.7 细胞共混培养。细胞铺板 24 孔板，以10% 的浓度分别加入破骨细胞前体培养液 (α-MEM +10% FBS + 100 U / ml 青霉素 + 100 μg / ml 链霉素 +35 ng / ml 巨噬细胞集落刺激因子 (macrophage colonystimulating factor，M-CSF) (注：RAW264.7 细胞共培养体系中不加) 及 40 ng / ml 鼠重组核因子 κ-B 配体受体致活剂 (receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL) 处理 Osteoblasts + Monocytes 或者 RAW264.7 细胞 3 天，然后分别与各组的 Th17 TNF-α+细胞以及 CD4+IL-17-细胞共培养 4 天[12]。结束实验后进行相关检测。

八、炎症细胞因子检测

麻醉后眼球取血约 1.2 ml，离心后取上清，检测采取酶联免疫吸附试验方法，按照试剂说明书进行测定，检测 IL-17A 的表达。

九、统计学处理

应用 Graphpad prism 8.0 软件进行统计学分析，实验结果以±s表示，两组间样本均数比较采用t检验分析，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、LPS 介导骨丢失现象，破骨细胞变化和血清 IL-17A 变化

LPS 组小鼠的 BMD 显著低于对照组，差异有统计学意义 (P＜ 0.05)，BV / TV、Tb.N、Tb.Sp 差异有统计学意义 (P＜ 0.05)，两组小鼠 Tb.Th 差异无统计学意义 (P＞ 0.05)。TRAP 染色结果，骨组织中的破骨细胞呈紫红色，LPS 组小鼠股骨干骺端破骨细胞增多，差异有统计学意义 (P＜ 0.05)。血清 ELISA 结果表明 LPS组IL-17A 有明显升高，差异有统计学意义(P＜ 0.01) (图1)。

二、骨髓血中 Th17 TNF-α+ 细胞表达增多

为了确定在骨髓血中潜在的具有促进破骨细胞分化能力的 CD4+T 细胞亚群的性质，分离 LPS组及对照组骨髓血中的 CD4+T 细胞，通过流式细胞术进行分析，结果表明 LPS 组的 Th17 TNF-α+/CD4+T 细胞比例明显增多，差异有统计学意义 (P＜0.01)。

三、Th17 TNF-α+ 细胞与两种破骨细胞诱导分化体系共培养结果

将 LPS 诱导骨丢失小鼠骨髓中的 Th17 TNF-α+细胞，CD4+IL-17-细胞分离出来，与成骨单核细胞系及 RAW264.7 细胞系共培养，TRAP 染色结果显示，Th17 TNF-α+细胞刺激破骨细胞分化数量增加(P＜ 0.05)，F-actin 环结果显示，表明破骨细胞功能增强 (P＜ 0.05) (图3)。

图3 a：TRAP 染色，Th17 TNF-α+ 细胞组显示破骨细胞数量明显增多；b：F-actin 结果，Th17 TNF-α+ 细胞组显示破骨细胞 F-actin 环相对荧光强度增强；c：TRAP 染色观察破骨细胞数目、肌动蛋白环荧光强度的定量Fig.3 a: TRAP staining, the Th17 TNF-α+ cell group showed a significant increase in the number of osteoclasts; b: F-actin, the relative fluorescence intensity of F-actin ring in the Th17 TNF-α+ cells group was increased; c: TRAP staining to observe the number of osteoclasts and the fluorescence intensity of actin rings

讨 论

骨质疏松症是重大的公共卫生问题，发病率在我国逐年增加，骨质疏松症是一种骨密度降低和骨微结构缺失的骨骼疾病，最严重的并发症是骨折[13]。高昂的经济成本、逐年升高的发病率和病死率使骨质疏松症的早期预防和治疗成为亟待解决的医疗难题[14]。炎症性疾病作为骨质疏松症发病的重要危险因素，有望成为骨质疏松症治疗的重要靶点[15-16]。微生物及其产物与炎症因子被认为在炎症性疾病的发生发展过程中发挥着重要作用，其中LPS 作为革兰氏阴性细菌的重要组成部分，可以刺激机体炎性反应的增强[17]。然而，LPS 参与炎症性疾病诱导破骨细胞的活化和骨丢失的具体机制尚不明确，缺乏 LPS 诱导系统性骨丢失的体内实验证据。本研究中使用 LPS 介导骨丢失模型，利用流式细胞术分选出 Th17 TNF-α+亚群，并明确了其在刺激破骨细胞的生成和调控中发挥重要作用。

LPS 是一种存在于细菌细胞壁的高度免疫原性的分子，有研究表明，在人体中，LPS 通过与 Toll样受体 4 (toll-like receptor 4，TLR4) 结合，激活固有免疫信号通路，增加炎症细胞因子的产生，从而造成骨丢失[18-19]。有文献指出，在膝关节骨关节炎患者的血清和关节液中，都检测到了 LPS，发现 LPS与膝关节炎的严重程度及滑膜中巨噬细胞的活化都有着密切关系[20]。还有文献报道，LPS 能促进间隙链接蛋白 43 (connexin 43) 的表达，从而使破骨细胞的生成增多，导致骨吸收能力增强[21]。目前研究认为 LPS 与 TLR4 的结合促进了机体炎症因子水平的表达和 M-CSF、RANKL 信号的激活，从而诱导了破骨细胞的分化，但缺乏相关的研究证明 LPS 与 TLR4的结合对 T 淋巴细胞亚群在极化过程中的影响，TLR4 的激活与免疫系统的活化之间的联系尚不明确[22]。本研究结果显示，在 LPS 注射 1 个月后，相较于对照组，LPS 组小鼠骨丢失明显增加，破骨细胞数量明显增加，骨吸收作用明显增强，这与之前的研究一致[23-24]，表明 LPS 是造成骨丢失的重要致病因素。LPS 组小鼠炎症因子 IL-17A 的表达显著升高，提示 Th17 细胞在这一过程发挥了作用。

T 淋巴细胞是骨重塑过程中的关键参与者，其产生的 RANKL 和 TNF-α 在许多病理和炎症状态下会导致骨破坏[25-26]。Th17 细胞是一种 T 淋巴细胞亚群，主要分泌 IL-17、IL-21 等，具有重要的免疫调节功能。在骨代谢中，Th17 细胞被认为是促进骨丢失的关键细胞类型之一，Th17 细胞参与破骨细胞的活化和分化，释放多种骨吸收因子如 RANKL、M-CSF等，导致骨质流失[27]。还有文献指出，Th17 细胞分泌的细胞因子，可以刺激成骨细胞、破骨细胞和巨噬细胞产生其它炎症介质，如前列腺素 E2、白介素-1β 和 TNF-α，从而间接促进骨吸收[28]。此外，与其它炎症性骨病 (RA、OA 等) 类似，Th17 / IL-17 轴还参与了牙周炎的发病机制[29-30]。本研究流式结果表明，Th17 TNF-α+细胞比例明显增多，提示其在调控破骨细胞功能中发挥重要作用，为此笔者将 Th17 TNF-α+细胞和 CD4+IL-17-细胞与两种破骨细胞诱导体系即成骨细胞、单核细胞体系，RAW264.7 细胞体系共混培养。发现 Th17 TNF-α+细胞不仅能够诱导 RAW264.7 细胞分化成破骨细胞，还能够增加RANKL 和 M-CSF 的外源性受体激活剂诱导的破骨细胞分化。无论是在成骨细胞、单核细胞体系还是RAW264.7 细胞体系，与 Th17 TNF-α+细胞共培养中的破骨细胞的 F-actin 环的光强度更强，表明破骨细胞运动和迁移、吞噬等方面的功能更强。这些结果加强了炎症、骨丢失与 Th17 TNF-α+细胞活性之间的联系，炎症环境募集了 Th17 细胞，刺激了破骨细胞的分化，从而导致骨丢失的恶性循环。

综上所述，LPS 能刺激 Th17 TNF-α+细胞亚群的比例增高，进而促进破骨细胞的增殖分化，深入研究 LPS 与 Th17 细胞之间的相互作用，有助于深入理解免疫调节机制，今后可能成为抑制炎症造成骨丢失的潜在治疗靶点。但本研究尚存在一些局限性，后续研究需进一步探索 Th17 的细胞相关分子机制。