基于黄酮成分优化张家口产湿生扁蕾的采贮研究＊

赵慧巧，李桐铜，聂 旋，张永鹏，靳国印，卢年华

（河北北方学院中医学院，河北 张家口 075132）

湿生扁蕾为龙胆科扁蕾属湿生扁蕾Gentianopsis paludosa（Hook.f.）Ma的一年生干燥全草，具有清热利湿，解毒之功效，主要用于感冒发热、肝炎、胆囊炎、肠胃炎、小儿腹泻等，是临床常用藏医药之一[1]。关于湿生扁蕾的品质研究多见于西北地区产地研究[2-3]，对河北地区湿生扁蕾的品质研究鲜有报道。湿生扁蕾主要化学成分包括黄酮类成分、口山酮类、三萜类、有机酸类等[4]。其中，黄酮类成分具有多方面生理活性，常作为湿生扁蕾药效学指标进行分析研究[1]。而木犀草素作为湿生扁蕾中黄酮类成分之一，已被证实具有抗腹泻、抗氧化、抗炎等多种生物活性[5]。

综上，文章以木犀草素及总黄酮含量为评价指标，对河北省张家口地区湿生扁蕾不同药用部位、采收期和贮存条件进行研究，以期为张家口地区野生药材的开发利用提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

可见分光光度计（型号：722s，上海精密科学仪器有限公司）；旋转蒸发仪（型号：RE-52AA，上海亚荣生化仪器公司）；分析天平（型号：BS224S，上海精密仪器仪表有限公司）。

1.2 材料

湿生扁蕾采自河北省张家口市，经河北北方学院鉴定为龙胆科扁蕾属湿生扁蕾Gentianopsis paludosa（Hook.f.）Ma，样品经净制干燥后，粉碎过40目筛，备用，见表1。木犀草素对照品（批号：191120，北京普天同创生物科技有限公司）、芦丁对照品（批号：DSTDL001601，成都徳思特生物技术有限公司）；乙醇（批号：20210102，山东安捷高科消毒科技有限公司）；甲醇（批号：20170208，天津市风船化学试剂科技有限公司）；甲酸（批号：20180208，天津市化学试剂一厂）；乙酸乙酯（批号：20180228，天津市风船化学试剂科技有限公司）；亚硝酸钠（批号20180108，天津市风船化学试剂科技有限公司）；硝酸银（批号：20200507，天津市永大化学试剂有限公司）；氢氧化钠（批号：20210213，天津市永大化学试剂有限公司）；无水氯化铝（批号：20190210，天津市光复精细化工研究所）；薄层硅胶板（批号：20210729，烟台华阳新材料科技有限公司烟台市化学工业研究所）；定量点样毛细管。

表1 不同批次湿生扁蕾样品及编号

2 方法

2.1 供试品溶液制备

称取各组湿生扁蕾样品10 g，置于250 mL圆底烧瓶中，加入10倍量70%乙醇浸泡药材0.5 h，回流提取1.5 h，过滤，滤渣加8倍量70%乙醇提取1.5 h，过滤，合并2次滤液，并置于旋转蒸发仪中回收乙醇，浓缩提取液得干浸膏，计算干浸膏率。

2.2 对照品溶液制备

精密称取干燥至恒重的木犀草素对照品2.000mg，加75%甲醇溶解并定容至2 mL容量瓶中，制成1mg/mL木犀草素的对照品储备液溶液。精密量取对照品溶液分别稀释成5 μg/mL（简称M1）和100 μg/mL（简称M2）的木犀草素对照品溶液。

精密量取干燥至恒重的芦丁对照品5.000 mg，加75%甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，摇匀，即得0.2 mg/mL的芦丁对照品储备液。

2.3 薄层色谱法检测湿生扁蕾中木犀草素

精密称取“2.1项下”各组湿生扁蕾干浸膏用75%甲醇配置成相当于原药材0.1 g/mL的样品溶液，分别标记为J1、J2、J3、J4、J5、G1、G2和G3。取各组湿生扁蕾样品溶液和木犀草素对照品溶液M1和M2各10 μL，分别点于硅胶G薄层板，以甲酸-甲醇-乙酸乙酯-甲苯（0.7：1：6：10）为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外灯254 nm下检视，观察样品溶液与木犀草素对照品在相同位置出现斑点的颜色及大小。

2.4 可见分光光度法检测湿生扁蕾中总黄酮含量

2.4.1 绘制标准曲线

精密量取“2.2项下”芦丁对照品储备液溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL与6 mL，分别置25 mL容量瓶中，各加75%甲醇至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加1%氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白对照品溶液，在500 nm波长处测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线得出回归方程：y=0.012 3x-0.009 7（相关系数R2=0.999 5），见图1。

图1 芦丁对照品标准曲线

2.4.2 总黄酮含量测定

精密称取“2.1项下”各组湿生扁蕾干浸膏用75%甲醇配置成相当于原药材0.1 g/mL的样品溶液，分别标记为J1、J2、J3、J4、J5、G1、G2和G3。精密量取0.6 mL，置25 mL容量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自加75%甲醇至6 mL起，依法测定吸光度，利用芦丁对照品标准曲线计算湿生扁蕾样品中总黄酮含量。

2.5 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行方差分析，P＜0.05，认为具有统计学意义。

3 结果

3.1 筛选湿生扁蕾最佳药用部位

20210827、20210912、20210925批次采收湿生扁蕾药材为样品，分别对其茎叶部位、根部开展实验。由图2可知，比较3批次湿生扁蕾样品木犀草素含量均为茎叶部位＞根部；由表2可知，3批次湿生扁蕾总黄酮含量均为茎叶部位＞根部，干浸膏率为茎叶部位＞根部，P＜0.05差异有统计学意义。综上所述，湿生扁蕾最佳药用部位为茎叶部位。

图2 不同药用部位湿生扁蕾木犀草素的薄层色谱图

表2 不同药用部位湿生扁蕾总黄酮含量和浸膏率（n=3）

3.2 筛选湿生扁蕾最佳采收期和贮存条件

取不同采收期、贮存条件下湿生扁蕾茎叶部位样品开展实验。由图3可知，定性比较各组样品中木犀草素含量，只有自然条件下贮存1年（J5）样品中木犀草素含量显著减少，其他各组木犀草素含量差异不大。

图3 不同采收期、贮存条件湿生扁蕾茎叶部位薄层色谱图

由表3可知，不同采收期样品湿生扁蕾茎叶部分总黄酮含量和浸膏率存在显著差异，P＜0.05，差异具有统计学意义，20210912批次样品（J2）中总黄酮含量最高，20210827批次样品（J1）中浸膏得率最高。由表4可知，不同贮存条件湿生扁蕾茎叶样品总黄酮含量和浸膏率存在显著差异，P＜0.05，差异具有统计学意义，当年样品（J2）中总黄酮含量最高，阴凉干燥贮存1年样品（J4）中浸膏得率最高。

表3 不同采收期湿生扁蕾中总黄酮含量和浸膏率（n=3）

表4 不同贮存条件下湿生扁蕾中总黄酮含量和浸膏率（n=3）

4 讨论

可见分光光度法对供试液的稳定性、仪器的精密度和测定方法的重复性，测定方法的准确性分别进行了考察，结果符合相关要求。文章分别采用薄层色谱法、可见分光光度法研究发现湿生扁蕾茎叶部位木犀草素含量、总黄酮含量均显著高于根部，浸膏率亦得到了一致结论。因此，依据黄酮类成分进行评价，湿生扁蕾的最佳入药部位应为茎叶。在《中华本草》中湿生扁蕾以全株入药，通过本实验初步证实这种说法可能欠妥。当然，本实验只针对黄酮类成分开展研究，对其他类成分是否也是茎叶部分更佳尚未考察。实验表明，8月底至9月底采收湿生扁蕾对木犀草素含量影响不大，但是总黄酮含量以9月中旬采收样品含量最高，考虑到湿生扁蕾种子成活率很低，野生品采收期应兼顾种子成熟及药材产量，本研究初步拟定9月中下旬为最佳采收期。贮存条件对湿生扁蕾中黄酮类成分具有显著影响，阴凉干燥处贮存显著优于自然环境贮存，且阴凉干燥处贮存1年与当年样品比较，木犀草素含量差异不大，总黄酮含量略有降低，湿生扁蕾最佳贮存条件应为阴凉干燥处。综上，湿生扁蕾应以茎叶部位入药，9月中下旬采收并置于阴凉干燥处保存。

采收期、药用部位、贮存是影响植物类药材的关键因素，对其进行充分的研究有助于科学制定药材采收和贮存方法[6]。对张家口地区野生药材湿生扁蕾开展相关实验研究，为湿生扁蕾药材的采、贮条件设定提供实验依据，对湿生扁蕾药材的开发利用具有指导意义。