CpG ODN及其纳米粒子递药系统在牙周炎治疗中的研究进展

张 茜 王 畅 曲星源 梁 琛 杜思雨 王 雷

胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸（cytosinephosphate-guanine oligodeoxynucleotide，CpG ODN）是人工合成的具有免疫刺激活性的非甲基化胞嘧啶- 鸟嘌呤二核苷酸的脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）重复序列，能诱导强烈的细胞免疫和体液免疫，增强机体免疫应答[1]。游离的CpG ODN 不易黏附细胞、极易被核酸酶酶解，因而使CpG ODN 的免疫效应大大降低。硫代修饰用于增强CpG ODN 的稳定性和免疫刺激活性，但它与不良反应的风险相关[2]。纳米递药系统是靶向递药的一种无创给药方式，实现药物至作用部位的直接、高效靶向输送，为CpG ODN 的高效传递和有效摄取提供了方法，增强了对机体的免疫效应，提高了机体的免疫应答，具有极大应用潜力。本文拟就CpG ODN 的研发进程，追踪其纳米粒子制备的研究进展及作用，展望其在牙周炎治疗方面的应用前景。

一、CpG ODN 简介

CpG ODN 是一类含有胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的寡聚脱氧核苷酸链，由CpG 二核苷酸及其5'端的2 个嘌呤和3' 端的2 个嘧啶组成，呈单链DNA 形式，含有1 个或多个非甲基化的CpG 基序，由于具有良好的促进免疫应答的效果而常在临床研究中被用作免疫增强剂[3]。基于CpG ODN 结构上的不同，现已鉴定出3 种类型的CpG ODN，即A，B，C型。不同种类的CpG ODN，其诱导的免疫应答性质亦有所不同。A 型含有部分硫代修饰，呈有序的G-四聚体高级结构，可以刺激人浆细胞样树突细胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）产生大量I 型干扰素（interferon，IFN-α），并能强烈活化自然杀伤（natural killer，NK）细胞，用于抗肿瘤、抗病毒免疫佐剂治疗免疫缺陷病[4]。B 型和C 型全部硫代修饰，不同的是，B 型含1 个或多个CpG 基序，能强烈刺激B 细胞增殖并分泌大量免疫球蛋白、白介素（interleukin，IL）-6、IL-10 和IL-12，并能刺激PDC成熟，但活化NK 细胞作用不如A 型，是亚单位疫苗、DNA 疫苗等疫苗佐剂的选择[5]。而C 型3'端回文序列形成二聚体，兼有A、B 两型的作用特点，能逆转Th1/Th2 免疫应答失衡，可作为自身免疫疾病的免疫刺激剂[6]。与其他佐剂相比，CpG ODN 在增强机体对抗原的反应方面具有更好的效果，尤其是对于免疫原性较低的抗原，以及当免疫原的剂量不足以引发有效的免疫反应时[7]。CpG ODN 作为一种良好的免疫佐剂，其本身不具有免疫原性，也不会诱导自身免疫反应[8]。现有研究发现，CpG ODN 可与B淋巴细胞和树突状细胞（dendritic cells，DCs）表达的Toll 样受体（Toll-like receptor，TLR）-9 相互作用，并诱导机体Th1 和促炎症细胞因子反应[9，10]，触发机体防御机制，引起明显而多样化的免疫反应。资料显示，TLR-9 是一类重要的模式识别受体，具有固有免疫刺激特性，它的刺激可导致两种不同的信号通路，导致促炎细胞因子（如IL-6 和（或）干扰素（interferon，IFN）的产生。这两类细胞因子对先天免疫和适应性免疫都有不同的影响[11]。目前CpG ODN在特应性皮炎[12]、大肠杆菌败血症[13]和黑色素瘤[14]等疾病研究方面效果显著，并在临床上得到初步应用。

二、CpG ODN 纳米粒子

纳米粒子是一类具有纳米级尺寸的生物材料，通常直径在10～1000 nm 之间，呈分散状或固体颗粒。纳米粒子能够将药物准确地传递到目标部位，因而受到了广泛的关注。纳米粒子递药系统的优势在于尺寸小，改善了细胞膜的跨膜运输、淋巴器官的靶向性和可持续的DC 激活，可以将药物输送到细胞内的特定区域；同时还可以改善药物溶解性、稳定性和安全性[15]。现有资料显示，纳米粒子递药系统主要包括脂质体、聚合物、无机物、树枝状大分子等阳性材料，对细胞膜具有强烈的粘附作用。基于纳米粒子的CpG ODN 递送进一步保护CpG ODN 免受DNA 酶的伤害，使CpG ODN 在体内长期滞留；提高细胞对CpG ODN 的摄取效率，将CpG ODN 递送到靶组织，使机体的免疫反应得到改善[16，17]。研究[18]显示，CpG ODN 在结合纳米材料后可以缓慢释放，96 小时内释放不到50%的载药量；但在pH 值降低时，促进纳米粒子的分解，并加速CpG 的释放，并被细胞内化，促进了其在细胞内的富集，增强了与TLR-9 的结合能力。此外，CpG 纳米粒子分散的稳定性与粒径分布、Zeta 电位相关，良好的尺寸和表面电荷不仅有利于纳米粒子在水溶液中的良好分散，而且促进细胞膜的结合和细胞的内化[19]。有学者[20]基于脂质体制备CpG ODN 纳米粒子，粒径分别为54.0 nm 和43.0 nm，电位分别为1.12±8.26 和0.34±11.2 mV，成功递送了CpG ODN，改善DC 细胞因子的产生和共刺激分子的表达，改善T 细胞反应和抗原特异性抗体反应，有很强的预防作用。真菌聚合物也是实现高效的传递系统之一。Tiwari 等人将CpG ODN 与裂藻素成功制备纳米粒子，在增强先天免疫反应方面具有更强的能力—包括产生活性氧、一氧化氮和诱导型一氧化氮合酶表达[21]。越来越多的研究表明，CpG ODN 纳米粒子具有广泛的应用价值，成为纳米科学和纳米技术重要的研究内容。

三、CpG ODN 及CpG ODN 纳米粒子在牙周炎中的应用

全球有一半以上人口患有不同程度的牙周疾病（包括牙周炎和牙龈炎），超过10%的人为重度牙周炎[22]。目前已公认牙周炎是多因素疾病，牙菌斑是引发牙周炎的始动因子。但是，宿主的免疫反应也会损害局部牙周组织，因此，除了机械手段的基础治疗外，在临床上常辅以药物治疗来减少牙菌斑中的牙周致病菌，阻止微生物入侵或扩散时发生的免疫反应[23]。近年来，有不少学者将CpG ODN 及CpG ODN纳米粒子用于牙周炎治疗的研究，并取得一定的研究进展。

1.促进成骨，减少骨吸收作用：促进骨的再生在牙周炎治疗中具有重要意义和价值。众所周知，在骨的改建过程中，成骨细胞和破骨细胞发挥着关键作用。Yu[24]等人探讨了CpG ODN 对小鼠胚胎成骨细胞MC3T3 增殖和成骨分化的调节作用，结果显示CpG ODN 调节MC3T3 细胞的成骨分化，增加成骨分化基因（如骨钙素）的相对表达，证明CpG ODN有望成为治疗牙周炎和促进骨再生的疗法。此外，有学者将CpG ODN 与N-乙酰基-L-亮氨酸改性聚乙烯亚胺制备纳米粒子作用于RAW264.7 巨噬细胞，发现此纳米粒子细胞毒性相对较低，转染效率较高，明显降低破骨细胞分化因子（如激活T 细胞的转录因子核因子NFATc、原癌基因c-fos、核因子-κB 受体激活剂 RANK 和基质金属蛋白酶9）的表达，从而减少破骨细胞的形成，在抵抗炎症和骨吸收方面起着重要作用[25]。CpG ODN 还可通过上调牙周组织中Runt 相关转录因子2 （Runt -related transcription factor 2，Runx2）和与成骨细胞分化和骨形成有关的转录因子（Osterix）的表达水平，降低炎症因子的表达来调控牙周组织改建，减少正畸力作用下大鼠牙齿的移动距离[26，27]。除了调控细胞基因表达，CpG ODN 对多种细胞周期和凋亡也可产生一定的影响。有证据表明，CpG ODN 影响MC3T3 细胞增殖和细胞周期[24]，显著降低RAW264.7 巨噬细胞的增殖，并诱导部分早期细胞凋亡[25]，还可促进感染状态下人成骨肉瘤细胞MG63 的细胞增殖，降低G1 期细胞百分比，促使细胞进入S 期并抑制细胞早期凋亡[28]。此外，有学者发现在不影响大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）形态的情况下，CpG ODN 可显著促进BMSCs 的增殖和成骨分化[29]。综上，骨重建受成骨细胞/破骨细胞之间的平衡、骨/免疫系统的相互作用调控。

2.抗炎作用：对于牙周病而言，其相关的免疫保护机制与黏膜免疫中唾液分泌型免疫球蛋白（secretory immunoglobulin A，S-IgA）的作用密不可分[30]。Bai 的研究[31]证明了CpG ODN 与牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2-fimA 组装的纳米粒子在诱导黏膜S -IgA 反应， 降低骨中环加氧酶 2（cyclooxygenase 2，COX-2）和核因子-κB 受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）表达方面的潜力，从而抑制炎症，减少破骨细胞的激活和分化，从而减少牙周炎骨吸收。此外，有研究发现 CpG ODN 可协同促进脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的RAW264.7 巨噬细胞增殖和迁移，提示CpG ODN 在炎症反应过程中具有重要的调节功能[32]。

B 淋巴细胞是牙周炎确立期和晚期的主要细胞，参与B 细胞介导的免疫防御，在牙周病发病机制起着重要作用。同时，B 细胞直接参与骨吸收的调节，并且是骨保护素的主要来源。研究发现，CpG ODN 不仅能诱导IFN 和促炎基因的低水平上调，并且可以强有力地激活B 细胞[33]，促进B 细胞介导的免疫调节作用。

3.抗菌作用：在牙周炎中，细菌的存在也是促进牙周组织的破坏的重要原因之一。众所周知，牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是牙周炎中主要的致病菌之一，可诱导炎症诱导的破骨细胞生成，并促进牙槽骨吸收。有学者研究发现，CpG ODN/DNA 质粒编码Flt3 配体纳米粒子可有效增强DCs，并提供平衡的Th1 和Th2 型细胞因子应答介导的特异性免疫球蛋白，可有效减轻P.gingivalis的感染[34]，防止P.gingivalis与唾液蛋白结合，抑制P.gingivalis在牙面上的黏附[35]。同样地，在Xiao[36]和Chang[37]的研究中，证实了CpG ODN 纳米粒子，控制P.gingivalis所致的口腔感染，显著减少与P.gingivalis感染相关的骨吸收。有学者[38]研究了P.gingivalisLPS 和CpG ODN 对先天性样B 细胞凋亡的影响，发现CpG ODN 能抑制先天性样B 细胞的早期和晚期凋亡，增强了P.gingivalisLPS 诱导的B细胞增殖，进一步提高了B 细胞免疫防御功能。

研究表明，CpG ODN 可以模拟细菌DNA，与TLR-9 结合，对先天性免疫和适应性免疫都有不同的影响，这种影响不仅表现在促进骨的生成，也体现在对细菌感染和炎症反应的抑制。而纳米材料的应用进一步提高了CpG ODN 的稳定性，从而更好地进入细胞内，作用于机体，产生免疫调节作用。

CpG ODN 是一种TLR 激动剂，也是一种免疫保护剂，用于抵抗细菌、病毒和原生动物感染。然而，CpG ODN 发挥作用与自身稳定性、受体结合能力，以及受体激活能力等诸多因素相关。因此，如何提高CpG ODN 的免疫活性，一直是人们思考的问题，其中纳米技术的应用为CpG ODN 发挥作用提供了新型药物递送系统和疗法，开辟了新思路。多项研究显示含有CpG ODN 的纳米粒子进一步提高了其免疫保护作用，使免疫效应得到改善，并广泛应用于免疫学的研究和治疗。值得注意的是，安全性始终是使用CpG ODN 的首要问题。目前有很多评估CpG ODN 的免疫活性和安全性研究，大多数研究表明，CpG ODN 纳米粒子较游离CpG ODN 在免疫治疗方面有更好的治疗作用，尚未发现其毒副作用。这与治疗方法高度相关，因为在某些情况下，这可能受益于免疫系统的刺激（如疫苗和抗癌应用），而另一些情况下可能受益于抑制免疫信号（如自身免疫性疾病）或避免免疫信号（如反义RNA 介导的有效载荷传递）的传递[39]。尽管CpG ODN 纳米粒子的研究在短期内均未发现明显异常，但是仍需持之以恒地观察与深入的研究。