口腔鳞状细胞癌人源异种移植模型的研究进展

王 宁 金武龙 彭 歆

口腔鳞状细胞癌（简称：口腔鳞癌）是一种上皮来源的恶性肿瘤，常发生在舌、颊、口底、牙龈及腭部等，约占头颈部恶性肿瘤的90%[1]。据2020 年《全球癌症报告》数据[2]显示，口腔鳞癌每年新发病例超过50 万例，约2/3 伴有肿瘤的局部浸润和区域淋巴结转移，发病率及死亡率均较高[3]。口腔鳞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，病情发展快，大多数患者在就诊时往往被确诊为中晚期或已发生颈部淋巴结转移，预后较差，5 年生存率低于50%[4]。

口腔颌面部解剖结构复杂，位置特殊，手术切除肿瘤导致患者语言、进食、面形等不同程度的功能性障碍，而晚期肿瘤常侵犯颅底、颈动静脉等多个重要的解剖结构，手术治疗难度大，术后易复发、预后较差，常需要有效的辅助治疗来提高患者的预后。随着分子生物学的发展以及相关标志物的应用，口腔鳞癌诊断方法日趋完善，但若想更进一步地研究口腔鳞癌发生发展机制、肿瘤与宿主之间的相互关系以及对各种新型治疗方案疗效进行评价、预测时，建立更加贴近于临床个体化患者的肿瘤动物模型是非常必要的。人源异种移植模型（patientderived xenograft models，PDX 模型）是指将新鲜肿瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠体内，依靠小鼠提供的环境进行生长的动物模型。相比传统的细胞系模型、基因工程动物模型、类器官模型等，PDX 模型是目前研究中最贴近于临床患者的模型，有可能成为口腔鳞癌临床前研究和药物筛选的首选模型。本文将口腔鳞癌PDX 模型与传统肿瘤动物模型进行比较并结合文献就口腔鳞癌PDX 模型的研究进展作一综述。

一、口腔鳞癌PDX 模型与传统肿瘤动物模型的比较

细胞系肿瘤模型是将体外培养的细胞系移植到动物体内构建的模型，其来源于体外培养的肿瘤细胞系，培养模式简单易行，肿瘤细胞生长速率稳定[5]，一直被用作临床前肿瘤药物研究的标准化工具。但随着研究发现，体外培养的肿瘤细胞系在培养过程中逐渐适应了体外环境，部分遗传物质被筛选，造成一些不可逆的生物学特性改变，并且通过这种方式培养的肿瘤细胞还缺乏相关的基质成分，丢失了原发肿瘤的遗传学特性和肿瘤异质性[6]。另有研究表明，原发肿瘤与来自该肿瘤相应的细胞系之间也存在着较大的遗传差异[7]。

遗传工程小鼠模型是将一个生物体的遗传物质有目的地干预或改变，然后定向地整合、转移到另一个生物体中形成模型，其来源为遗传物质，对研究特定基因功能具有很大的优势，极大地推进了疾病机制以及功能基因组学研究的进程，但该模型通常有特定的遗传学特性，不能代表具有复杂遗传特性和不稳定基因组的人类恶性肿瘤。

PDX 模型是将新鲜的肿瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠体内，依靠小鼠提供的环境生长的动物模型。PDX 模型是直接来源于患者的肿瘤组织，未经体外培养及其他干预，完整地保存了原发肿瘤的形态结构、分化程度、基质成分，继承了原发肿瘤所有的分子生物学特性[8]，与其他动物模型相比，PDX模型在反映肿瘤异质性方面具有很大的优势[9]，还能反映肿瘤细胞与肿瘤微环境之间复杂的相互关系，在模拟肿瘤组织生长、转移、血管形成以及免疫抑制等方面具有独特的优势[10，11]。研究表明，PDX 模型在短代小鼠传代时，在整体基因表达模式、突变状态、转移潜力、药物反应和肿瘤结构方面具有生物学稳定性，与细胞系移植模型相比，这些特征提供了显著的改进[12]。

PDX 模型的受体是具有免疫缺陷的小鼠，目前常见的主要有裸鼠、严重联合免疫缺陷小鼠（SCID）、非肥胖糖尿病/重度联合免疫缺陷小鼠（NODSCID)、NOG 小鼠等[13]。近年来，PDX 模型逐渐成为研究肿瘤生物学和评估抗肿瘤药物的有效工具，广泛应用于肿瘤发生发展机制研究、临床预后预测、药物筛选、生物标记物开发以及肿瘤患者个体化治疗等方面[14]，为多种恶性肿瘤的研究提供了一个稳定可靠的临床前期平台。

二、口腔鳞癌PDX 模型的应用

1.生物标志物识别：据报道[15]，口腔鳞癌中5 个最常见的突变基因是TP53、FAT1、NOTCH、PIK3CA和CDKN2A。Yang 等[16]建立3 个晚期口腔鳞癌PDX模型，寻找潜在的治疗靶点，通过对原发肿瘤及配对PDX 模型进行全外显子组和RNA 测序，证明了CHEK1、PIK3CA 和PIK3CD 的表达在口腔鳞癌中显著上调。之后，对原发肿瘤及PDX 模型的转录组谱及转录组数据库进行了分析，结果提示PDX 模型重现了原发肿瘤相似的基因组特征，表明PDX 模型是口腔鳞癌相关的临床前模型，并提示CHK1 和PI3K是口腔鳞癌有前途的靶点。

遗传学研究报道TP53 是口腔癌中最常见的突变基因，TP53 突变是头颈部恶性肿瘤预后不良的生物标志物[17]。Sun 等[18]发现23 个口腔鳞癌PDX 模型中有17 个检测到TP53 基因突变，NOTCH1、NOTCH2、CDKN2A 基因也常突变，这证明它们在口腔鳞癌中可能代表患者间的分子异质性，也有学者在口腔鳞癌PDX 模型中也证明了此报道[16]。另有报道表明，个性化患者的PDX 模型已被用作体内平台，用于测试基于患者肿瘤基因图谱提出的治疗策略[19]。

Konrad 等[20]收集89 例头颈部鳞癌患者的115个肿瘤样本建立了PDX 模型，大约52 个在组织学外观上稳定生长，其中29 个PDX 模型到达第三代后可进行临床前药物敏感性筛选。通过对原发肿瘤及PDX 模型HE 染色和测序，显示PDX 模型肿瘤与相应患者的肿瘤特征相似，在PDX 模型中检测到TP53 和PIK3CA 突变显著。

Christina 等[21]通过建立大量的头颈部鳞癌PDX模型，表明基因组中G1/S 检查点通路的解除与移植相关。CCND1 和CDKN2A 基因组的改变可预测CDK4 和CDK6 抑制剂的反应，结论支持CDK4 和CDK6 抑制剂作为头颈部鳞癌患者的治疗策略，提示利用PDX 模型确定靶向治疗的潜力，这些靶向治疗将使预后较差的患者受益。

护理前，两组甲状腺功能差异无统计学意义（P＞0.05）；护理后，B组甲状腺功能均低于A组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 1。

在头颈部鳞癌的发生发展机制中，目前公认的PI3K 信号通路相关基因的突变、扩增或缺失都会导致PI3K 通路异常激活[22]。Sun 等[18]将头颈部鳞癌PDX 模型分为“PI3K 通路激活模型”和“PI3K 驱动模型”，在这两种PDX 模型上分别进行PI3K 通路靶向药物筛选和生物标志物预测，另外，还将PDX 模型与遗传类疾病相结合，通过对PDX 模型及患者对比分析，有可能为遗传特性相似的患者提供相应的治疗。Li 等[23]成功构建了头颈部鳞癌PDX 模型，并进行了蛋白质组学研究。通过反向蛋白阵列分析评估了190 个通常参与信号转导的候选总蛋白和磷酸化蛋白的表达水平，结果发现PDX 模型中大多数蛋白质是保守的，但有证据表明，与增殖信号相关的蛋白质可能在构建PDX 模型过程中被优先选择。然后对4778 个肿瘤标本进行分析并与PDX 模型比较以确定蛋白表达的一致性，结果显示几乎所有的PDX模型蛋白表达都聚集在头颈部鳞癌样本的主要分支内，PDX 模型的整体蛋白质谱和原发性肿瘤非常相似，这是第一次将PDX 模型与头颈部鳞癌的蛋白质组学进行分析，这提示蛋白质表达的稳定性代表着一种有前景的临床前模型系统，可用于头颈部鳞癌机制和治疗的研究。

2.化学治疗：目前，以顺铂为基础的化疗是复发或转移性口腔鳞癌的标准治疗方法[24]。顺铂作为口腔鳞癌的一线化疗药物，疗效满意，但副作用严重，因其在治疗过程中产生耐药及敏感性降低的现象在很大程度上削弱了治疗效果。据统计，约有30%的患者最初对铂类药物不敏感，也有原对药物敏感的患者经三、四轮化疗后出现不同程度的耐药[25]，基于这种现象，探索提高口腔鳞癌对顺铂敏感性的新策略显得尤为重要。顺铂单独或联合5-氟尿嘧啶和多西他赛治疗是目前口腔鳞癌最常用的化疗方案，但化疗耐药性是口腔鳞癌治疗失败的重要因素之一。化疗耐药是由多种因素引起的，包括药物积累减少、药物靶点相互作用减少、肿瘤干细胞数量增加及自噬活性增强等。

Omprakash 等[26]收集了17 例未接受过化疗和17 例接受新辅助化疗但未有反应的口腔鳞癌患者活检标本，利用裸鼠制备PDX 模型，来评估顺铂、酮咯酸盐任一单药及两药联合使用对口腔鳞癌的影响，结果提示联合用药显著抑制肿瘤生长，同时酮咯酸盐还可恢复顺铂诱导化疗无效的口腔鳞癌PDX模型肿瘤细胞死亡。对于复发的晚期口腔鳞癌患者，酮咯酸盐与顺铂联合治疗值得进一步临床研究。

Konrad 等[21]构建52 例头颈部鳞癌PDX 模型，评估多西紫杉醇、卡铂、5-氟尿嘧啶及甲氨蝶呤的治疗效果，结果显示多西紫杉醇治疗效果最为显著，即使5-氟尿嘧啶，卡铂和甲氨蝶呤的最大耐受剂量，一般情况下单一药物不会导致显著的生长抑制。

在晚期和化疗耐药口腔鳞癌PDX 模型中，顺铂类化疗药物治疗机制还需进一步的临床研究。

3.靶向治疗：口腔鳞癌是一种侵袭性肿瘤，细胞周期失调和表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）通路扩增被认为是口腔鳞癌发病的关键因素[27]，EGFR 在90%以上的头颈部鳞癌中过表达。西妥昔单抗，一种EGFR 抗体，是FDA批准的唯一用于口腔鳞癌的分子靶向药物[28]，然而，并不是所有患者对EGFR 靶向治疗都有效，绝大多数患者对该治疗随着时间推移产生耐药性[29]，这表明对具有不同遗传和分子特征的口腔鳞癌患者，还需其他有效的靶向治疗。

目前，许多靶向通路的抑制剂被评估为口腔癌的候选治疗药物，例如，palbociclib 和abemaciclib 是细胞周期相关激酶CDK4 和CDK6 的抑制剂，在头颈部鳞癌PDX 模型中显示出抗肿瘤作用[20]。

伊维莫司，一种靶向mTOR 信号通路的化合物，是一种新的治疗选择。PI3K/AKT/mTOR 通路的失调是头颈部鳞癌发病机制的常见事件，但mTOR抑制剂尚未被引入临床常规应用[30]。Konrad 等研究表明29 例PDX 模型中20 例显示出对依维莫司有明显的生长抑制作用，这一进步证明了这种化合物在头颈部癌症中的活性。

伊曲康唑是FDA 批准的一种新型抗癌药物[31]，已通过人体安全性测试，既往研究表明其是一种很有前途的Hh 通路拮抗剂和抗血管生成剂，并在基底细胞癌中证实了这一点[32]，然而，伊曲康唑在口腔鳞癌中的潜在用途尚未被研究。Ban 等[33]通过口腔鳞癌PDX 模型研究发现，用伊曲康唑处理过的小鼠凋亡小体是对照小鼠的2.29 倍，表明伊曲康唑能诱导PDX 模型肿瘤细胞凋亡；同时，PDX 模型显示影响Hh 信号通路，这是第一个证明使用抗真菌药物伊曲康唑作为一种新的口腔鳞癌治疗选择的可行性研究，研究结果可为进一步研究伊曲康唑在口腔鳞癌中的应用提供参考。

Wang 等[34]建立头颈部鳞癌PDX 模型，研究表明双重靶向EGFR 和HER3 优于单独靶向EGFR，西妥昔单抗耐药细胞系和PDX 模型一致表明，西妥昔单抗上调HER3 和HER2/HER3 二聚体是头颈部鳞癌耐药EGFR 抑制的一个潜在机制，结果支持在西妥昔单抗治疗失败的患者中使用多重靶向策略可进行进一步的临床研究。

4.联合治疗：越来越多的研究表明，口腔鳞癌的联合治疗效果明显优于单药治疗效果，Yang 等[16]通过口腔鳞癌PDX 模型，评估顺铂、CHK1 抑制剂、PI3K 抑制剂及联合治疗效果，结果显示单药治疗只能部分抑制PDX 模型肿瘤生长，而联合治疗对肿瘤生长抑制效果显著，研究为抑制CHK1 与抑制PI3K或顺铂联合治疗作为一种新的口腔鳞癌治疗策略提供了原理证据。在铂类和氟尿嘧啶治疗的基础上添加西妥昔单抗，可以改善复发或转移性头颈部鳞癌患者的总生存期，EGFR 基因突变和来自HER3 和其他EGFR 家族成员的代偿信号被认为与头颈部鳞癌对西妥昔单抗治疗的敏感性有关[35]。Wang 等通过6 例头颈部鳞癌PDX 模型研究结果提示西妥昔单抗和HER3 抑制剂联合治疗显著抑制肿瘤生长；这是首次使用PDX 模型证明联合EGFR 和HER3 的双重靶向策略比单独应用EGFR 抑制剂治疗头颈部鳞状细胞癌更有效。

5.其他治疗：Farshad 等[36]使用口腔鳞癌PDX 模型来描述肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）的存在和行为的差异与其肿瘤起源相关，CSC 被认为是头颈部鳞癌局部复发和区域扩散的一个可能的驱动因素[37]，Sun 等[38]成功构建PDX 模型后进行研究CSC在口腔鳞癌中的作用，证明c-Met 抑制剂具有优先靶向肿瘤干细胞的治疗潜力。Sun 等[18]在组织学、分子学和药理学水平上对口腔鳞癌PDX 模型进行了广泛的表征，确保他们能代表临床情况的多样性。研究报道[39]，PDX 模型在数量上被认为是可再生的组织资源；在质量上，其稳定性和临床预测价值显著。PDX 模型平台可能会在一个共临床试验项目中实施，进行患者分层和优化治疗。

光生物调节治疗（photobiological regulation therapy，PBMT) 是预防口腔黏膜炎的有效方法，然而，PBMT 对口腔鳞癌的影响尚未完全阐明。Silveira等[40]在口腔鳞癌PDX 模型中，证实了PBMT 不影响肿瘤生长、增殖和细胞周期，此外，2017 年Antunes等[41]提示PBMT 甚至可能提高放化疗治疗头颈部鳞癌患者的生存率。最近的一些研究发现，PDX 模型是一个有前途的领域，通过获得头颈部鳞癌的扩展，正在建立头颈部鳞癌PDX 模型数据库，支持基础科学和临床前研究。

三、改进型PDX 模型

目前，PDX 模型在多种不同实体肿瘤研究中已被证明有助于预测患者化疗疗效和指导临床治疗决策。但PDX 模型也存在一些局限性：①宿主为免疫缺陷小鼠，缺失了人体免疫微环境；②平均成瘤时间较长，药敏检测所需时间也较长；③移植成功率通常低于50%；④随着肿瘤的增殖和传代，人类来源的肿瘤基质将被鼠源组织所代替，速率约为3～5 代，5、在移植的过程中，不可避免地丢失一部分遗传特性，对原始肿瘤的异质性存在一定影响。

有研究者为弥补PDX 模型所存在的一些局限性，对PDX 模型进行了改进，主要有以下几种。①MiniPDX 模型[42]：作为PDX 模型的补充，是一种快速的PDX 药敏检测技术，最大的优势在于MiniPDX模型药敏检测试验只需7～10 天，明显短于传统PDX 模型药敏检测所需的4～6 个月，同时所需的肿瘤组织量更小、成本也更低，但是，以细胞悬液代替组织是否会破坏肿瘤微环境，使MiniPDX 与原发肿瘤在长期一致性上受到影响，有待进一步证实。②人源化异种移植模型：以具有部分人免疫系统功能的小鼠建立的PDX 模型，模拟肿瘤与免疫系统之间的相互作用，因而能用于肿瘤免疫方面的研究，弥补了PDX 模型缺失人免疫微环境的不足。然而现有的人源化异种移植技术还不尽成熟，人源化小鼠制作复杂，建模成功率低，成本难以控制，难以应用于临床实际工作中。③原位人源异种移植模型：将人源的肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠对应或相近的组织器官而建立的模型。优点在于原位移植可以提供更加接近原发瘤的环境，有利于原发瘤的正常生长，但是由于原位移植的肿瘤多位于胸腹腔内，传统检测手段难以观察肿瘤的生长情况，体外测量肿瘤体积误差相对较大，对于转移灶的识别也存在更大的困难。另外，操作复杂，降低了原位移植模型的成功率，暂时未得到广泛应用。