激素性股骨头坏死发病机制的研究进展

成衍男 潘振宇

糖皮质激素(GCs)在临床上使用十分广泛,由此诱发的激素性股骨头坏死(GA-ONFH)的发病率逐年上升,发病年龄亦日趋年轻。国内每年报告新发病例在100～200万[1]。多数病人罹患后会在2～3年内股骨头塌陷,随后髋关节发生骨性关节炎。大部分病人最终只能选择关节置换。GCs引起 GA-ONFH的发病机制可能与骨髓间充质干细胞(BMSCs)成脂/成骨分化异常、氧化应激、细胞凋亡与自噬、炎症和免疫、外泌体调控、及非编码RNA的异常表达等因素相关。本文主要围绕GA-ONFH致病机制进行综述。

一、BMSCs成脂/成骨失衡

BMSCs是一种具有自我更新和多能分化潜力的细胞,它们能够分化为多种不同类型的细胞,包括成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞等。长期大剂量使用糖皮质激素可能会破坏BMSCs成骨和成脂分化的平衡,影响骨修复能力,增加髓内脂肪的堆积。有研究说明,从皮质醇诱导的股骨头坏死病人体内提取的BMSCs的细胞增殖能力及成骨分化能力显著下降。体外皮质类固醇诱导的BMSCs中脂肪细胞数量增加,脂肪特异性基因表达增强,但成骨基因表达降低[2]。GCs通过糖皮质激素受体(GR),激活Wnt/β-catenin、TGF-β/BMP、Notch等信号通路调控BMSCs成脂或成骨分化[3]。此外,GCs可以正向或负向调节多种转录因子(Runx2、PPARγ、C/EBP、TAZ)。有研究发现,GCs上调BMSCs中C/EBPα的表达促进成脂分化是通过抑制组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)来实现的[4]。HDAC3表达降低激活了BMSCs中启动子区域中PPARγ的组蛋白H27K1乙酰化水平,这一过程最终导致BMSCs成脂分化增强。

二、氧化应激及活性氧机制

GCs在正常生理水平下对于发育、代谢、成骨细胞分化和骨形成至关重要。过量GCs导致活性氧自由基(ROS)积累,产生氧化应激来影响骨代谢相关细胞(骨细胞、成骨细胞、BMSCs、破骨细胞)及血管内皮细胞的功能,最终引起骨组织内环境失衡,细胞发生内质网应激和线粒体功能损伤。皮质类固醇诱导的股骨头坏死模型的早期就可以发现氧化应激。有研究表明,GA-ONFH病人氧化应激和(或)抗氧化标志物在体内异常表达[5]。核因子E2相关因子2(Nrf2)作为主要应激反应转录因子在氧化还原稳态中起核心作用,keap1/Nrf2通路失衡是GA-ONFH发生的关键因素之一。大量研究表明,GCs耗竭单酰基甘油脂肪酶(MAGL),抑制抗氧化通路keap1/Nrf2的激活,造成BMSCs中ROS过载,发生氧化损伤和细胞凋亡[6]。GCs可以下调编码抗氧化酶相关基因(NAD(P)H、HO-1)和抗氧化酶(γ-GCS、SOD1)在股骨头内的表达,引起微环境氧化应激,产生大量的ROS,激活破骨细胞活性,RANKL、组织蛋白酶K表达增加,激活或募集更多破骨细胞,造成骨量减少、骨质流失,最终导致GA-ONFH的发生[7]。

三、个人易感性和遗传

个体易感性和遗传因素在GA-ONFH中发挥了某种程度的作用。大量的研究表明,PAI-1、ABCB1、IL1B、MMP2、MMP10和CYP450等基因的多态性和GA-ONFH密切相关。一项病例对照研究结果显示,PAI-4基因的5 G/1 G多态性是GA-ONFH的危险因素[8]。还有研究发现,IL1B rs1143630降低了GA-ONFH的风险,IL1B rs2853550增加了类固醇诱导的GA-ONFH的风险[9]。类似研究证实了与ABCB1(C3435T)的TT和TC基因型相比,CC基因型与骨坏死风险增加有关,ABCB1 3435T等位基因降低了GCs诱导的ONFH风险[10]。中国人群中MMP-2rs2241146和rs11646643与单侧GA-ONFH存在患病风险,而MMP-10中rs470154则使得患双侧类固醇诱导股骨头坏死的风险增加[11]。

四、细胞凋亡和自噬

GCs导致细胞发生凋亡是GA-ONFH的主要特征之一。内质网应激诱导的细胞凋亡在许多疾病中都被观察到,而GCs治疗会导致内质网应激并引起各种变化,包括成骨细胞、骨细胞和内皮细胞的功能障碍和凋亡。内质网应激抑制抗凋亡蛋白BCL-2的表达,导致线粒体中BAX含量增加,从而启动Caspase9/Caspase3信号通路,最终触发细胞凋亡。过量活性氧(ROS)的细胞内积累导致内质网应激增加,线粒体DNA(mtDNA)损伤,线粒体功能障碍,也能激活BCL-2 / BAX细胞凋亡途径。大量研究表明,GCs通过抑制PI3K / AKT 通路诱导成骨细胞细胞凋亡和线粒体损伤[12]。

自噬是真核细胞中的溶酶体通过降解细胞中受损的细胞器和蛋白质为细胞提供营养的过程。但过度的自噬也会破坏细胞成分。在骨重塑中,成骨细胞和破骨细胞对GA-ONFH有重大意义。自噬所需要的蛋白质(Atg4B和LC3)对破骨细胞的分泌功能和体内、体外骨吸收非常重要。自噬发生的关键蛋白FIP200的缺失会抑制成骨细胞自噬,导致骨质的流失和骨量下降[13]。 此外,有研究表明,GCs导致BMSCs中Parkin下调和p53上调,其自噬水平降低,线粒体损伤积累,最终导致凋亡和衰老。通过上调Parkin并下调p53的表达水平,可以显著增强BMSCs的线粒体自噬,并减少受损线粒体在细胞内的积累,有效抵御氧化应激所诱导的细胞损伤,从而改善了BMSCs移植对早期类固醇诱导的骨坏死的影响[14]。

五、凝血功能异常及血栓

减少血管数量和破坏局部血液供应被认为是GCs诱导的股骨头坏死的重要因素之一。GCs诱发内皮细胞凋亡,破坏凝血纤维蛋白溶解系统,促进股骨头内血管微血栓形成,造成股骨头内血供减少,最终导致GA-ONFH的发生。纤溶酶原激活物抑制剂1型(PAI-1)是一种糖蛋白,通过与组织纤溶酶原激活剂形成复合物来调节纤维蛋白溶解。高剂量GCs引起股骨头微环境PAI-1水平增高,继而诱发凝血功能障碍,血流减缓,使微循环中血液呈现高凝状态及血栓形成[15]。Liu等[16]对小鼠进行血管紧张素Ⅱ和天冬酰胺酶联合处理后,相关凝血因子(Ⅲ、Ⅴ、Ⅹ)水平显著升高,提高了小鼠GA-ONFH的发生率。

六、炎症和免疫

在以前的研究中,炎症已被证明在GA-ONFH的发展和进展中起着不可或缺的作用。已有研究表明,通过收集GA-ONFH病人血清后检测基因表达谱,将8个基因(BIRC5、CBL、CCR1、LYN、PAK1、PTEN、RAF4和TLR10)确定为GA-ONFH的候选血清生物标志物,而在功能上,这些候选血清生物标志物在GA-ONFH进展过程中参与几种病理过程,例如免疫调节和炎症,骨代谢和血管生成[17]。而在GA-ONFH的动物模型中,骨坏死组织中中性粒细胞和巨噬细胞升高,同时坏死骨可以通过激活Toll样受体4(TLR4)和上调下游转录因子包括核因子-κB(NF-κB)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)刺激巨噬细胞调节炎症反应[18]。单核细胞起源于骨髓中的造血干细胞并在骨髓中发育。有研究发现,相比于其他原因导致的股骨头坏死,类固醇导致的骨坏死病人骨髓标本中的单核细胞数量高3倍[19]。GCs可以在体内和体外直接作用于单核细胞,诱导单核细胞扩增,同时通过增加细胞因子信号传导抑制因子3(SOCS3)、FOS样1(Fosl1)、Forsb、白细胞介素-1受体1型(IL1R1)、白细胞免疫球蛋白样受体成员3A(Lilrb3a)、配对的Ig样受体B(Pirb)和破骨细胞相关的Ig样受体(Oscar)的表达,使单核细胞向破骨细胞分化,发挥其炎症反应和碎骨能力,最后导致骨量流失,血供减少[19]。

七、非编码RNA在GA-ONFH中的作用

1．MicroRNA:miRNA在多种生理过程中发挥着至关重要的作用,包括发育、细胞增殖、分化、代谢、迁移和凋亡,同时也参与了GA-ONFH的发生和发展。

在GA-ONFH病人(对照组为股骨颈骨折病人)中坏死骨、骨髓血及外周血中均存在miRNA的表达谱差异[20]。Li等[21]在3例类固醇诱导的ONFH病人的股骨头的坍塌区和非坍塌区发现了8个miRNA上调(has-miR-4472,has-miR-4306,has-miR-4747-5p,has-miR-4441,has-miR-4709-3p,ebv-miR-BHRF1-2-3p,has-miR-585-3p和has-miR-5572),两个miRNA下调(has-miR-195-5p和has-miR-645)。目前,已经发现了大量的miRNA直接或者间接参与GA-ONFH的致病过程,主要是参与调节脂肪生成、细胞凋亡、成骨和血管生成相关通路。Cao等[22]发现,miR-224-5p在GC处理的BMSCs中上调,miR-224-5p可以抑制BMSCs的成骨,但促进BMSCs的成脂分化。GCs通过上调miR-30b-5p的表达,抑制RUNX2通路及下游基因(MMP3、MM9、Col10a1),介导股骨头软骨细胞发生凋亡[23]。

2．长链非编码RNA(lncRNA):lncRNA对于许多疾病的发生和发展至关重要。有研究显示,从GA-ONFH病人获取的BMSCs中lncRNA的差异表达谱,其中有1 878个lncRNA上调和1 842个lncRNA下调[24]。这些lncRNA的靶基因参与细胞增殖、分化和迁移等过程。某些lncRNA具有某些miRNA的“种子序列”,它们能够像海绵一样结合miRNA,从而阻止miRNA与其靶mRNA结合。最近的研究发现,lncRNA Tmem235能够结合miR-3a-5p,抑制miR-3a-5p对下游基因BIRC的调控,有效抑制了缺氧环境下BMSCs的凋亡,并提高了BMSCs在GA-ONFH的早期移植疗效[25]。lncRNA LINC00473可以通过激活miR-23a-3p/LRP5/Wnt/β- catenin信号通路轴来促进成骨并抑制BMSCs的脂肪生成,同时,通过激活miR-23a-3p/PEBP1/Akt/Bad/Bcl‐2信号通路轴从Dex诱导的细胞凋亡中拯救BMSCs[26]。

3.环状RNA(circRNA) :与lncRNA相似,circRNA包括多个miRNA结合位点,类似于海绵吸附水,将miRNA与靶mRNA“隔离”,从而影响miRNA对靶mRNA的负调控。已有研究使用circRNA微阵列分析筛选了类固醇诱导的GA-ONFH中的circRNA表达谱,鉴定出多达182个差异表达的circRNA,其中108个circRNA显著上调。而上调最明显的circRNA(称为circHGF)可以通过靶向miR-25-3p/SMAD7轴抑制GA-ONFH中BMSCs的增殖和成骨分化[27]。Chen等[28]通过GA-ONFH来源BMSCs中筛选出了820种差异表达的circRNA,其中circRNA CDR1as通过调控miR-7-5p-WNT5B促进BMSCs发生成脂分化,而敲低circRNA CDR1as增强了BMSCs成骨分化能力,同时减弱 BMSC 的成脂分化能力。

八、外泌体在GA-ONFH中的应用

外泌体是由细胞形成的直径为50～100nm的细胞外脂质结构囊泡,这些囊泡将生物活性蛋白、脂质和RNA传递到靶细胞进行细胞间通讯,其发挥的作用与其来源的细胞功能相似。外泌体治疗GA-ONFH具有显著的潜力,这些外泌体主要来源于脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞、CD34阳性干细胞、脐带间充质干细胞、BMSCs和尿液来源间充质干细胞。除此之外,血小板来源的外泌体可以减少GA-ONFH中细胞凋亡的发生。来自GA-ONFH坏死骨的外泌体可导致CD41蛋白表达降低,通过调控整合素β3-FAK-Akt-Runx2通路,抑制BMSCs的成骨分化和迁移从而诱导GA-ONFH发生[29]。在此病理过程中,GA-ONFH坏死骨的外泌体导致BMSCs缺乏CD41成骨能力下降而无法修复坏死骨可能是GA-ONFH加重的主要原因[29]。而更值得注意的是,Li等[30]发现与健康的小鼠同住可以延缓GCs处理导致的股骨头坏死,同时挽救GCs诱导的肠道动物乳杆菌减少,而口服补充动物乳杆菌通过增加血管生成、增强成骨和减少细胞凋亡来减轻GCs诱导的 GA-ONFH,来自动物乳杆菌(L.animalis-EVs)的细胞外囊泡含有丰富的功能蛋白,可以进入股骨头发挥促血管生成、促成骨和抗凋亡作用。

GA-ONFH发病机制仍在持续研究之中。一般认为,GA-ONFH的发生并不是单因素所致,而是多因素并存,破坏了股骨头局部微环境的骨代谢平衡,使骨质流失、骨量下降、血管内皮细胞损伤和血供受损。GA-ONFH的早期症状并不明显,症状明显时多处于进展期和终末期,治疗十分棘手。因此,早期预防和治疗的研究具有重要的临床意义。深入探讨GA-ONFH的致病靶标可能会成为治疗GA-ONFH的新方向。