皮肤衰老评价方法的研究进展

宋姣 陈斌 秦燕 张文娟 鲁楠

[摘要]本文介绍了皮肤老化的形式及外在皮肤表象，回顾了目前常用抗衰老功效评估方法及各自的优缺点，包括生物化学方法、细胞生物学法、动物试验法和人体试验法，同时着重介绍了皮肤超声、在体荧光光谱法此类新型的评估方法在抗衰老临床评估中的应用，以及不同配方剂型对产品功效性能的影响。

[关键词]抗衰老；功效评估；体外评估；在体评估；在体荧光光谱法；配方影响

[中图分类号]R751    [文献标志码]A    [文章编号]1008-6455（2023）06-0203-03

Research Progress of Skin Aging Evaluation Methods

SONG Jiao，CHEN Bin，QIN Yan，ZHANG Wenjuan，LU Nan

（Shanghai Pechoin Biotechnology Co.Ltd， Shanghai 201499，China）

Abstract： This paper briefly introduces the form of skin aging and external skin appearance， reviews the common anti-aging efficacy evaluation methods and their advantages and disadvantages， including biochemical method， cell biology method， animal test and human clinical evaluation method， and focuses on the application of new evaluation methods such as skin ultrasound and in vivo fluorescence spectroscopy in the clinical anti-aging evaluation ， and the influence of formulation type on efficacy evaluation.

Key words： anti-aging; efficacy evaluation; external evaluation; in vivo evaluation; in vivo fluorescence spectrometry; formula influence

随着人们对抗衰老护肤品需求的增加，护肤品相应功效评估的方法也在增加，尤其是2021年中国国家药品监督管理局发布了《化妆品功效评价宣称规范》，指出了化妆品在注册备案前需要提供相应的功效宣称的依据，更是推动了抗衰老护肤品功效评估方法的开发及完善。本文回顾了目前常用抗衰老化妆品功效评估的方法及其各自的优缺点，重点介绍皮肤超声和荧光光谱法在人体临床功效评估中的应用和配方剂型对功效评估的影响。

1  皮肤老化：光老化与自然老化

皮肤老化一般有两种表现形式，自然老化和光老化。自然老化主要指随着年龄的增长，由机体内存在的如遗传、内分泌及免疫功能等不可抗拒因素引起的老化。自然老化的外在表现为皮肤变得薄且扁平、干燥、弹性降低，分子生物学水平上的表现为细胞外基质普遍萎缩，成纤维细胞数量减少，胶原蛋白和弹性蛋白水平降低[1]。光老化主要由于紫外线的作用，加重了自然衰老的进程，气候变化以及环境污染等对皮肤光老化也有一定的影响[2]。光老化的皮肤会出现皱纹、松弛、粗糙、色素沉着、肤色不均匀等，表皮厚度增加，结缔组织改变。光老化皮肤的关键特征是表皮-真皮结合处下方无定形弹性蛋白物质的积累[1]。

抗衰老是通过使用此类功效性的护肤品来预防或减缓皮肤因自然或/和光老化而产生的皱纹、干燥、松弛和色斑等。

2  如何评估护肤品的抗衰老功效

目前，抗衰老的功效评估包括体外评估、动物实验法和在体评估法。

2.1 抗衰老体外评估法：体外评估主要有生物化学法、细胞生物学法。生物化学法主要是自由基清除试验，这些过量的自由基主要是由氧化应激反应产生，可以造成和或加速皮肤自然老化和光老化。常用的自由基主要有1.1-二苯基-2-苦肼基（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羟基自由基、超氧自由基、单线氧自由基、氮自由基等。

细胞生物学法主要有2D细胞法和3D皮肤模型法，此法主要是通过2D细胞（角质形成细胞、成纤维细胞等）[3-4]及3D皮肤模型中和衰老相关指标的变化来评估样品的功效性，常见的检测指标有水通道蛋白（Aquaporin，AQP）、与氧化相关的酶及蛋白、与屏障功能相關的紧密连接蛋白[5]、与弹性相关的胶原蛋白等。

体外评估具有简单、快速，高通量筛选的优势，主要用来评估原料的功效性或者探索原料/产品发挥功效的机理通路。但此类方法也存在一定的缺陷，测试因素单一，不能全面反映测试样品的特性，无法考虑样品真实的代谢吸收等影响因素。

2.2 抗衰老动物实验法：动物实验法主要通过化学物质或紫外线等对老鼠进行诱导来进行皮肤老化造模，然后通过皮肤观察、组织染色、免疫染色或者试剂盒检测等来分析和老化相关的指标[6]。D-半乳糖亚急性衰老模型是目前国内最常用的动物衰老模型之一，正常剂量的D-半乳糖可在肝脏被酶解代谢为葡萄糖，而过量的超出机体负荷的D-半乳糖则会致使机体产生活性氧自由基从而降低了抗氧化能力，使体内超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase， GSH-Px）水平下降，提高丙二醛（Malonic dialdehyde，MDA）含量，最终对机体造成氧化损伤[7]。

动物实验可以考虑测试样品真实的吸收代谢等性能，但其也存在物种差异，与人应用的效能也存在一定的差异，且随着欧盟禁止使用动物进行化妆品研究后，日本的资生堂等公司也陆续提出取消动物实验，后续动物实验能否继续用于化妆品的功效测试也有待商榷。

2.3 抗衰老在体评估：抗衰老在体评估主要有临床评估、图像分析、仪器评估，要获得相对准确客观的评估结果，往往需要这些方法联合应用，建立一套综合评估的方案。

2.3.1 临床评估法：临床评估主要包括受试者自评和专家评估两个部分。受试者自评主要通过问卷来获得受试者自身对于使用产品前后皮肤老化表象的变化。专家评估主要是由有经验的皮肤科医生根据事先制定的标准对测试部位的皮肤老化情况进行分值评估，这些标准有行业内公认的判定标准，如欧莱雅集团的皮肤老化分级图谱、日本的眼部皱纹分级图谱等；或者机构根据自己的经验总结的一套成熟的、经过验证的判定标准。临床评估法主要用于目前仪器无法直接检测分析的指标，或者辅助仪器测试进行评估分析，此方法的结果相对主观，主要依靠于评估的人员主观性感受和经验性判断。

2.3.2 图像分析法：图像分析主要是通过专业仪器采集测试部位的皮肤图像，然后分析测试部位皮肤的老化特征，此方法既可以获得直观的皮肤变化的图像，也可以通过软件（Image-Pro Plus，IPP）分析获得相对客观的数据。目前图像分析较多用于皮肤纹理和质地的分析，包括全脸和局部纹理，主要评估皮肤的粗糙度、皱纹的深度及长度等[1]。此外，图像分析也可以用来评估皮肤颜色、红区、斑点、毛孔等变化，可用于舒缓、祛斑、美白等功效的评估。

2.3.3 仪器分析法：仪器分析是直接使用皮肤测量仪检测产品使用前后皮肤老化相关指标的变化。随着皮肤老化，皮肤的含水量、屏障功能、弹性、肤色、皮肤的厚度和密度等都变得越来越差，这些指标变化都可以采用仪器测试进行量化体现[8]。含水量、屏障功能、弹性、肤色这些指标一直都是衰老评估的重要指标[9]，评估方法也相对比较成熟，可选择的仪器也比较多。

皮肤厚度和密度是近年来发展起来的衰老的评估指标。皮肤的厚度和密度主要是通过高频超声仪进行测量，频率范围20～100 MHz，可观察表皮、真皮、皮下组织上部以及附件和小血管[10]。低频率可以到达皮肤较深的地方，图片分辨率较低；高频率可以观察皮肤较浅的地方，图像的分辨率较高。皮肤高频超声图像分为三层：入口回声（强回声，角质层角化角质细胞），真皮回声（弥漫回声，根据测试位置胶原纤维数量和水化程度有不同的回声），皮下组织回声很低或无回声。胶原纤维数量越多，组织回声越强，细胞间质含量越高，回声越低[10]。

皮肤各层厚度和回声的变化与皮肤自然老化和光老化都有关。皮肤密度反映了真皮中胶原蛋白和弹性蛋白的水平，而皮肤厚度则反映了与年龄相关的皮肤变薄程度以及改善真皮结构的潜力[11]。年轻的皮肤呈现出更强的回声和更均匀的厚度，反映了这层结构和角质细胞的完整性。随着光老化、弹性蛋白变性、胶原纤维编织结构的变化和糖胺聚糖聚集导致表皮下低回声带（Subepidermal low echogenic band，SLEB）在真皮中形成。从真皮上部SLEB的存在和大小可以推断光老化的严重程度，因此，SLEB可以作为判断皮肤光老化的一个重要指标，随着年龄的增长，低回声带的相对回声强度降低，厚度增加[10，12]。

除了上述评估方法外，还有一些其他仪器也可以联合使用来评估皮肤的老化。笔者实验室2020年的一项研究发现，荧光光谱仪也可以用来在体检测皮肤老化的情况。笔者单位采用荧光光谱分析仪FL7000分别采集了154名21～60岁女性受试者的光暴露部位和非暴露部位的晚期糖基化终末产物（Advanced glycation end products，AGEs）、类胡萝卜素（Carotenoids）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）和色氨酸（Tryptophan，Trp）这4个自身可发荧光，并与皮肤的自然老化和光老化密切相关的指标[13]。AGEs是糖基化的终产物，在内源性衰老的发生发展中起着重要作用，且与皮肤光老化也密切相关。类胡萝卜素作为抗氧化剂可以保护皮肤，减少污染、紫外线辐射和氧化应激造成的皮肤损伤和老化[14]。色氨酸会随着年龄的增长逐渐减少，可以反映皮肤的老化。通过分析这4个指标在不同年龄段、不同测试部位的数据，以未暴露部位的AGEs作为内在衰老的参数，类胡萝卜素作为暴露部位的保护因子，NADH作为危险因子，色氨酸作为暴露部位光老化的指标，建立皮肤生理年龄指数。该指标综合了内在衰老、光老化、危险因素和保护因素等指标，能较好地反映当前皮肤的生理年龄，预测衰老发展，为后续护肤品的开发和使用提供建议[15]。

2.3.4 临床评估影响因素—配方剂型：抗衰老功效性的评估不仅与使用部位、使用频率、使用周期、配方中活性物质的添加量等基本因素有关外，也与产品配方的特性有关。笔者实验室近年的一项研究发现，单次使用后即刻，同样同剂量活性物的水劑（Toner）、水包油（O/W）、油包水（W/O）、硅油包水（W/Si-O）配方对皮肤角质层含水量、纹理质地方面的改善存在较大的差异，数据结果显示角质层含水量Toner＞O/W＞W/O＞W/Si-O，使用后2 h，O/W＞Toner＝W/O＞W/Si-O；而在皮肤质地改善方面，使用后即刻，W/O的改善效果最好，使用后2 h，O/W效果最好。分析这一结果猜测，即时皮肤含水量的改善与配方中水的比例有关，而长期效果则与水的比例和油脂的含量皆有关。W/Si-O体系对于皮肤含水量和改善细纹方面没有明显优势，但其可以优化提升产品的使用肤感。在改善皮肤细纹方面，W/O配方即时效果最好，O/W则长期效果上表现更好。根据这一结果，我们认为产品的剂型对产品的功效有提升的作用，针对保湿功效宣称的产品，O/W配方的效果可能会更好一些；而W/O配方则更适用于抗皱类的产品。因此，不同类型的配方在改善皮肤肤质方面效果存在一定的差异性，可以根据产品的目标功效宣称，选择合适的配方，以更好地达到改善肌肤的效果。同时，我们在设计产品的功效测试方案时，也应该根据产品的剂型选择更为合适的测试指标和仪器来进行功效评估。

在体功效评估相对于体外评估和动物实验更客观准确，通过受试者直接使用，来检测分析其实际应用效果，主要是用来筛选配方或产品的功效性；但其需要考虑的影响因素也比较多，如目标人群的选择、使用部位、使用频率、受试者的顺应性、测试时间（季节因素等）、测试方法的选择等。

抗衰老功效评估时，可以将体外和在体联合应用，如在原料筛选中，可以选择先采用体外评估方法进行高通量筛选获得一个或几个潜在的原料，后续再进行人体测试其临床功效性，在临床测试中，可以将图像分析、临床评估及仪器测试联合使用，从多个维度评估可能的效果和获得配方中的添加量的选择。在产品测试中，也可以在人体临床评估的基础上，采用体外评估辅助获得可能的作用机理和通路，为产品的宣称提供机理性辅助，尤其是现在许多消费者比较注重产品的成分和皮肤学机理，即所谓的“成分党”，这种组合评估的模式，既能满足品牌方的产品功效宣称需求，又能满足消费者成分机理关注的心理。

3  小结

随着人们生活水平和生活质量的不断提高，大家除了对日常基本的衣食住行关注之外，也提升了对面部容颜变化的关注。从古至今，“青春永驻”一直都是一个永恒的話题，抗衰老化妆品也越来越受到人们的关注与应用。因此，对这些产品功效评估方法的需求也在迅速增长。对于抗衰老的功效性评估，要根据实际需求，选择合理的评估方法，可以选择体外、在体相结合，或者多种在体评估方法联合使用，挖掘产品功效的一切可能性，为产品的功效宣称方向提供技术支持。同时，在现有的评估方法的基础上，结合现代新的科学技术、皮肤科生理学发展，开发新的评估方法，为产品的开发和消费者的护肤选择提供更多的方向。

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[收稿日期]2021-06-29

本文引用格式：宋姣，陈斌，秦燕，等.皮肤衰老评价方法的研究进展[J].中国美容医学，2023，32（6）：203-205.