抗大别班达病毒药物研究进展

吴兵安,余晨阳,钱汐晶,戚中田

发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS)是一种由新型布尼亚病毒——大别班达病毒(Dabie bandavirus,DBV)引起的高致死性传染病[1],于2009年首次在中国中部农村地区报道[2]。截至目前,我国至少有20个省份报告了SFTS病例,且病例数量逐年增加[1]。此外,韩国[3]、日本[4]和美国[5]等地也已陆续报告了SFTS病例,这说明DBV 极有可能已经在全球存在并开始蔓延[6]。在自然界中,长角血蜱是DBV的主要传播媒介[7],因此,蜱虫叮咬是人类患病的主要途径。此外,人类也可通过接触患病的家畜或SFTS患者的体液而感染病毒[8-9]。SFTS患者典型的临床症状为高热(体温≥38 ℃)、疲劳、胃肠道症状(厌食、恶心、呕吐、腹泻、腹痛)、血小板及白细胞减少等[10-11],严重者可出现外周血小板迅速减少、多器官功能障碍、甚至死亡[12-13]。由于尚无有效的抗病毒药物[10],临床上以对症治疗和支持治疗为主,SFTS患者病死率可高达30%[14]。因此,急需研发安全高效的抗DBV药物。

DBV属于布尼亚病毒科白蛉病毒属,是一种负链RNA病毒[15]。其基因组由大(L)、中(M)和小(S)[16]3个RNA片段组成。L区段编码的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)负责介导病毒RNA的复制和合成[17]。M区段编码的2种糖蛋白—Gn和Gc,与病毒的结合和膜融合过程密切相关[15],也是中和抗体的作用靶点。S区段编码病毒核蛋白(nucleoprotein,NP)和非结构蛋白(non-structural protein,NSs)。NP是DBV颗粒及其感染细胞中表达最丰富的蛋白,其包裹病毒基因组RNA(vRNA),形成核糖核蛋白复合物(RNPs),以维持vRNA的稳定性。此外,NP还在病毒RNA转录、复制以及组装中发挥重要作用[18]。NSs是DBV重要的毒力因子,可抑制宿主固有免疫反应[19]。由于这些蛋白在DBV生命周期中的重要作用,使其成为抗病毒药物研发的重要靶点。近期研究发现,靶向DBV蛋白的药物在体内外具有较好的抗病毒活性。此外,一些作用于宿主细胞的化合物也可抑制DBV的感染。本文对目前抗DBV药物研究进展及其作用机制进行综述,并探讨其应用前景,为SFTS患者的临床治疗提供更多选择。

1 法匹拉韦

富山化学有限公司制造的法匹拉韦(favipiravir,T-705)是一种新型的RNA聚合酶抑制剂[20],对流感病毒、沙粒病毒、布尼亚病毒、西尼罗病毒、黄热病病毒和口蹄疫病毒等多种RNA病毒具有广谱抑制活性[21]。研究发现,T-705在体内外均具有显著抗DBV活性。T-705可抑制DBV在Vero细胞中复制,其 IC90为22 μmol/L。I型干扰素受体敲除的A129小鼠和STAT2敲除的金色叙利亚仓鼠(DBV致死性感染的动物模型)感染DBV后,对照组小鼠在5～7 d内全部死亡,而给予T-705治疗可使A129小鼠和STAT2敲除的金色叙利亚仓鼠免于DBV致命感染[22-23]。临床试验表明,通过T-705治疗,日本SFTS的CFR降低约10%。此外,T-705还可降低SFTS发病率。因此,T-705可能是预防和治疗SFTS患者的有效药物。然而,在T-705治疗期间,患者经常出现肝功能异常。由于DBV感染可引起肝脏损伤,因此尚不清楚患者肝功能异常是否仅为T-705的副作用[24]。

2 利巴韦林

利巴韦林(ribavirin)是一种核苷酸类似物,对多种DNA和RNA病毒具有抑制活性,如呼吸道合胞病毒、流行性感冒病毒、麻疹病毒、疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、拉沙病毒和丙型肝炎病毒[25]。研究表明,利巴韦林可在多种细胞系中抑制DBV的复制(在Vero、Huh7和U2OS细胞中,其IC99分别为263、83和78 μmol/L)[26]。然而,利巴韦林在I型干扰素受体敲除A129小鼠和STAT2敲除金色叙利亚仓鼠等致死性DBV感染模型中的保护作用非常有限。根据一项在我国进行的大规模流行病学研究(包括2011—2017年间确诊的2 096例SFTS患者),利巴韦林治疗可将病毒载量小于1×106拷贝/mL的患者CFR从6.25%降至1.16%。然而,在病毒载量大于1×106拷贝/mL的患者中未观察到明显的治疗效果[27]。目前,利巴韦林在临床中治疗SFTS患者的效果仍在进一步研究中。

3 钙通道阻断剂

钙通道阻断剂可降低细胞内Ca2+水平,广泛用于治疗各种心血管疾病,包括高血压、心绞痛和室上性心律失常等。近期研究表明,钙通道阻断剂对埃博拉病毒[28]、马尔堡病毒[29]、西尼罗河病毒[30]和日本脑炎病毒[31]等多种病毒均具有抑制活性。Li H等从FDA批准的药物库中进行高通量筛选,发现盐酸贝尼地平(benidipine hydrochloride)和硝苯地平(nifedipine)2种钙通道阻断剂对DBV具有显著抑制作用,其中盐酸贝尼地平抑制作用最强[32]。研究发现,盐酸贝尼地平在Vero和Huh-7细胞中均能抑制DBV感染,且抑制效果呈剂量依赖性,其在Vero细胞中的IC50为1.412 μmol/L。进一步研究发现,盐酸贝尼地平通过减少病毒诱导的Ca2+内流来抑制DBV的内化和复制。体内实验表明,盐酸贝尼地平可显著降低C57BL/6小鼠组织中病毒载量,减轻DBV引起的病理损伤和临床症状。此外,在人源化小鼠模型(DBV致死性感染动物模型)中,盐酸贝尼地平的治疗可显著降低小鼠死亡率。进一步地,Li H等对SFTS患者进行了回顾性临床研究(包括83名在入院前和住院期间接受硝苯地平治疗的硝苯地平治疗者,48名在入院前接受硝苯地平治疗但住院期间未接受硝苯地平治疗的非硝苯地平治疗者,以及249名完全未接受硝苯地平治疗的普通患者),发现硝苯地平可以提高病毒清除率,改善临床恢复。硝苯地平治疗组的CFR(3.6%)比普通组(19.7%)或非硝苯地平治疗组(20.8%)降低了5倍以上[32]。因此,盐酸贝尼地平和硝苯地平是抑制DBV感染和降低SFTS患者CFR的潜在有效治疗药物。

4 蛋白酶体抑制剂

蛋白酶体系统作为真核生物中主要的非溶酶体蛋白质降解系统,在细胞增殖、分化和蛋白质降解中起着重要的调节作用。此外,它还参与病原体的入侵、致病性和机体的免疫反应[33]。研究表明,许多病毒利用蛋白酶体系统来促进其复制和释放。因此,抑制蛋白酶体降解途径是抑制病毒增殖的有效措施[33]。硼替佐米(PS-341)是一种二肽硼酸类似物,也是首个临床批准的用于人类的蛋白酶体抑制剂[34],已证明其在体外具有抗病毒活性[35]。研究发现,PS-341具有显著抗DBV活性,50 nmol/L PS-341可使293T细胞中DBV感染率下降60%。实验证明,PS-341通过直接抑制DBV的感染性以及DBV的复制和释放发挥显著的抗病毒活性[33]。NSs是DBV的主要毒力因子,在固有免疫应答的调节中起重要作用[36]。NSs可通过泛素依赖的途径抑制视黄酸诱导基因-1(RIG-I)的降解,抑制IFN启动子的激活,阻断下游信号通路的激活并抑制IFN-β的产生[33],从而拮抗机体的抗病毒作用。而PS-341可逆转DBV NSs介导的RIG-I降解,拮抗NSs对干扰素的抑制作用并阻断病毒复制。此外,PS-341还可通过影响IFN系统和宿主细胞凋亡来抑制DBV增殖[33]。由于PS-341已经用于临床,其安全性较高,因此进一步研究PS-341在动物体内和临床患者体内抗DBV活性,将具有潜在的应用前景,为SFTS患者的治疗提供一种新的选择。

5 抗体类药物

抗体在抑制病毒入侵过程中具有重要作用,可通过抗体依赖性细胞毒作用诱导感染细胞的溶解[37-38]。抗体还可通过靶向病毒受体或干扰病毒-受体相互作用阻断病毒入侵靶细胞[15]。其在汉坦病毒[39]、巨细胞病毒[40]和呼吸道合胞病毒[41]等多种病毒性疾病的治疗中发挥着关键作用。

Kim KH等从1例SFTS恢复期患者产生的抗体库中筛选出与Gn糖蛋白结合的单克隆抗体Ab10,其在体内外表现出有效的抗病毒活性。956 nmol/L的Ab10 可使Vero细胞中DBV感染率下降90%。进一步研究发现,Ab10对90%以上已报道的DBV分离株具有抑制作用。通过交联剂辅助质谱和丙氨酸扫描,发现Ab10与Gn结构域II和茎区上的非线性表位结合,表明Ab10可能抑制病毒和宿主细胞之间的膜融合过程。A129小鼠感染2或20 PFU剂量的DBV,对照组所有小鼠在7 d内死亡,而Ab10治疗组所有小鼠均存活,并且未出现体重减轻[10]。这表明Ab10有潜力发展成为一种有效的抗DBV药物。

Guo X等从5例SFTS康复患者外周血制备的抗体库中筛选的单克隆抗体MAb4-5在DBV感染的Vero细胞中具有显著中和活性。研究发现,MAb4-5通过阻断Gn与细胞受体结合来介导中和作用。此外,MAb4-5对我国分离的大部分DBV毒株均具有显著中和活性,这表明MAb4-5的结合表位在不同DBV毒株中具有保守性。并且MAb4-5的表位是线性表位而不是构象表位,这有助于相关疫苗的设计。中和抗体不仅可以降低病毒载量,抑制病毒传播,同时也可用于高危人群的预防[15]。因此,MAb4-5可能是一种有效预防和治疗DBV感染的候选分子。

可变重链结构域(variable heavy chain domain,VHH)是重链抗体的单一可变结构域(12～15 kDa),天然存在于骆驼科动物体内[42]。VHH是目前已知的最小功能性抗体片段,也称为纳米抗体或单结构域抗体[43]。近年来,纳米抗体由于其高溶解性、热稳定性、低毒性和低免疫原性而被广泛研究,用于治疗肿瘤、炎症、传染病和神经系统疾病的纳米抗体药物正在研发中[44-45]。Wu XL等用DBV Gn的胞外结构域(sGn)免疫骆驼,鉴定出23种具有中和活性的纳米抗体,其中SNB02的中和活性最强。研究表明,SNB02可有效抑制DBV感染PBMC和Vero E6细胞,其IC50小于2.7 μg/mL。人源化NCG小鼠感染DBV后给予SNB02(400 μg/只),可显著降低小鼠血清中病毒载量,减轻小鼠体重下降程度,改善由DBV感染引起的肺脏、肝脏中炎症细胞浸润和肾小球充血等病理改变。此外,SNB02处理的小鼠的血小板计数显著高于对照组,这表明SNB02有效预防了DBV引起的血小板减少症[46]。因此,SNB02是治疗SFTS潜在的候选药物,有望进入临床进行进一步试验。

研究发现,小鼠感染DBV后,其淋巴结、脾脏以及血清中IL-12、IL-6、IL-1α、IL-1β和IFN-γ显著上调,而IL-6被认为是与SFTS患者疾病严重程度相关的关键指标[47-48]。因此,Bryden SR等检测了预防性和治疗性给予IL-6抗体对DBV感染小鼠的影响。结果表明,预防性使用IL-6抗体不影响小鼠存活率。而治疗性给予IL-6抗体可显著减轻小鼠临床症状,并使DBV感染小鼠的生存率提高50%[49]。IL-6抗体治疗策略不直接作用于病毒,而是靶向宿主针对病毒感染的反应过程。这表明调节宿主细胞的炎症反应可能是治疗SFTS患者的一种有效策略。

6 抗寄生虫药物

研究表明,用于治疗疟疾的阿莫地喹(amodiaquine)具有广谱抗病毒活性,可抑制登革病毒[50]、埃博拉病毒[51]和新冠病毒[52]等多种病毒的复制。Baba M等发现,阿莫地喹衍生物C-90可有效抑制DBV 的复制,且抑制效果呈剂量依赖性,其IC50为2.5 μmol/L。然而,C-90 对DBV感染的C57BL/6J小鼠保护作用非常有限。这可能是由于C-90几乎不溶于水或PBS,口服生物利用度很低,无法发挥其抗病毒作用[53]。

用于治疗锥虫病和蠕虫病的苏拉明(suramin)可特异性结合DBV NP,在Vero细胞中具有显著的抗病毒活性[54-55]。抗疟疾药物青蒿素(artemisinin)通过干扰DBV NP与宿主葡萄糖-6-磷酸异构酶之间的相互作用,在体外也具有显著抗病毒活性[56]。

7 肽类化合物

由于肽阻断蛋白与蛋白相互作用位点更具特异性,并且比小分子化合物耐受性高,因此,肽和基于肽的抑制剂代表了一种有吸引力的小分子化合物替代物[57]。目前已研发出针对流感病毒和冠状病毒等多种新兴病毒的抗病毒肽[58]。Yuan SF等合成的环肽HKU-P1在体外具有显著抗DBV活性,可使Huh-7细胞中病毒载量减少50%以上。研究发现,HKU-P1只有与病毒共孵育时才具有显著抗DBV活性,这表明HKU-P1极有可能直接作用于病毒颗粒,而不影响其入侵、复制等生命周期。此外,HKU-P1与抑制DBV复制的法匹拉韦具有协同作用,可增强法匹拉韦抗病毒活性[58]。

8 干扰素

干扰素(interferon,IFN)是一种分泌型细胞因子,有3种类型:I型、Ⅱ型和III型[59],在固有免疫中发挥重要作用。其中,I型和III型IFN具有广谱的抗病毒活性[59],而Ⅱ型IFN(IFN-γ)仅对少数病毒具有抑制作用[60]。研究发现,SFTS患者血清中IFN-γ水平显著升高,表明DBV感染后诱导强烈的IFN-γ应答反应[61]。Ning YJ等发现,IFN-γ在体内外均具有较好的抗DBV活性。在HepG2细胞中,IFN-γ预处理可显著抑制DBV感染,抑制效果具有浓度依赖性。然而,在病毒感染4 h后加入IFN-γ,其抑制效果明显减弱。ICR乳鼠(3 d)感染DBV后,对照组乳鼠在13 d内全部死亡,而在病毒感染前给予IFN-γ治疗,可显著减轻乳鼠体重下降程度,并使其生存率提高25%。然而,在病毒感染24 h后给予IFN-γ治疗,其对乳鼠无任何保护作用,表明在病毒感染建立后,DBV可拮抗IFN-γ的抗病毒作用,这与体外实验结果一致[61]。这些结果表明,IFN-γ极有可能作为一种预防性药物来降低DBV的感染率和CFR。

9 其他抗DBV药物

咖啡酸(CA)是咖啡豆中富含的绿原酸降解产物,具有多种有益的生物效应,包括抑制癌细胞转移、增殖[62]和抗病毒效应[63]。研究发现,DBV感染Huh7.5.1-8细胞同时加入CA,CA以剂量依赖性方式抑制病毒感染,其IC50为0.048 mmol/L,选择指数为158;而CA与DBV提前孵育,可增强CA的抗病毒作用,其IC50为0.019 mmol/L,选择指数为400。进一步研究发现,CA不影响病毒颗粒的完整性,但可抑制病毒的感染性[64]。因此,CA是一种潜在的可用于预防和治疗SFTS药物,值得进一步深入研究。

氟化嘌呤类似物磷酸氟达拉滨(fludarabine)是用于治疗慢性淋巴细胞白血病的化疗药物[65],其在体内被代谢为三磷酸氟达拉滨后与核酸结合,通过抑制核糖核苷酸还原酶和DNA聚合酶来抑制DNA合成[66]。体外实验表明,氟达拉滨可在多种细胞中有效抑制DBV感染,且抑制效果呈浓度依赖性,其在Vero细胞中的IC50值为0.83 μmol/L[67]。氟达拉滨作为一种小分子药物,具有较长的半衰期和良好的生物利用度,有望成为一种有效的抗DBV药物。

Smee DF等发现核苷类抑制剂2′-氟-2′-脱氧胞苷(2′-Fluoro-2′-deoxycytidine,2′-FdC)在体内外均具有较好的抗DBV活性[68]。此外,治疗慢性髓性白血病的高三尖杉酯碱(omacetaxine mepesuccinate,HHT)可通过干扰DBV核蛋白与宿主核糖体蛋白L3之间的相互作用,在体外具有显著抗DBV活性[56]。有研究发现硝噻柳酸酰胺的衍生物硝唑尼特(nitazoxanide)也可抑制DBV的复制[17]。

10 讨 论

DBV是一种新型蜱传布尼亚病毒,其引起的SFTS死亡率最高可达30%,具有重要的医学意义[69]。由于其高致死率和导致疫情传播的可能性,SFTS已被世界卫生组织列为急需研究的十大传染病之一[32]。尽管如此,目前仍无有效的疫苗或药物用于预防或治疗DBV感染[49],以降低患病率和CFR。以上报道的化合物在体外或体内显示出较好的抗DBV活性,其中T-705和利巴韦林已进入临床试验。然而,SFTS患者在使用法匹拉韦时,肝功能异常发生率显著升高[24];利巴韦林在临床上的治疗效果仍存在较大争议。黎浩等通过回顾性临床研究,发现钙通道阻断剂硝苯地平可使SFTS患者CFR降低5倍以上[32],但尚未开展硝苯地平治疗SFTS患者的临床试验。此外,用于小鼠体内研究的硝苯地平剂量(100 mg/kg·d)远远高于人类口服剂量(0.2～1.5 mg/kg·d)。因此,钙通道阻断剂用于临床治疗SFTS患者的安全性仍需进一步评估[27]。其余药物均未进入临床试验,难以在短时间内用于SFTS患者的治疗。DBV自然宿主和传播媒介的广泛分布为该病毒的全球传播提供了可能性[32]。2018年,DBV被世界卫生组织列为优先病原体[49]。因此,研发有效抗DBV药物非常必要。近年来,从药物库中高通量筛选策略极大促进了药物研发进程,有望在短时间内寻找出有效的抗DBV药物,为SFTS患者的临床治疗提供新的选择。

利益冲突：无

引用本文格式：吴兵安,余晨阳,钱汐晶,等.抗大别班达病毒药物研究进展[J].中国人兽共患病学报,2023,39(9):893-899.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.098