基于ERK1/2通路探讨八宝丹抑制骨肉瘤生长的机制

陈鹏，张冬龙，刘宇，林庆宾，刘俊宁，洪振强*

（1.福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122；2.中医骨伤及运动康复教育部重点实验室，福建 福州 350122；3.厦门市集美街道社区卫生服务中心，福建 厦门 361021）

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是由间质细胞异常活化增生导致的一种恶性骨肿瘤，近年来呈现出快速增长的趋势，其转移甚至致死率也大幅增加［1］。临床上用于骨肉瘤的化疗药物很多，如甲氨喋呤、阿霉素、阿糖胞苷、环磷酰胺等［2］，其中大剂量甲氨蝶呤配合甲酰四氢叶酸（HD-MTX—CFR）解救是化疗的重要方案之一［3］。该方案中，为了能达到较好的化疗效果，甲氨蝶呤的用量较常规用量大十数倍甚至几百倍，其不良反应明显，严重者导致患者死亡［4］。骨肉瘤的防治已成为当前医学亟待解决的问题之一，因此寻找安全有效的药物对于该病的临床治疗具有积极意义。

近年来，运用中药复方治疗骨肉瘤的报道十分常见，主要是因为这些复方在很大程度上可抑制化疗药物的毒副作用，同时对癌细胞本身具有良好的抑制作用［5］。八宝丹作为祖国医学经典名方，以其清热解毒、活血止痛之功，在治疗病毒性肝炎、前列腺炎、胆囊炎等方面发挥显著疗效［6-8］。在扩大其临床应用的同时，八宝丹治疗中、晚期癌症也展现出良好的药效价值［9］。大量研究表明，除八宝丹本身具有抑制癌细胞增殖的作用外，其作为癌症治疗的辅助用药还具有增效减毒之功，在很大程度上提高患者的生存期［10-11］。然而，目前八宝丹治疗骨肉瘤的作用机制仍不清楚，值得进一步探讨。

前期课题组已经证实，U2OS细胞中ERK1/2的表达显著上调［12］。而ERK1/2信号通路在肿瘤发生发展过程中发挥重要的调节作用，尤其是在骨肉瘤中能够作为细胞转移的加速剂，推动骨肉瘤的恶化发展［13-14］。目前，多种针对该信号通路的激酶抑制剂已经进入临床研究［15］。ERK1/2信号通路的大致模式为：多种生长因子→Ras→Raf→MEK1/2→ERK1/2→细胞生长、发育、分裂、分化［16-17］。骨肉瘤发病机制复杂，并且针对八宝丹抑制骨肉瘤细胞增殖的机制研究报道较少，故本实验以U2OS骨肉瘤细胞作为研究对象，通过观察八宝丹抑制骨肉瘤细胞增殖、促进其凋亡的具体作用机制与ERK1/2信号通路的关系，明确八宝丹抗骨肉瘤作用的部分作用机制。

1 实验材料

1.1 实验细胞与药物 U2OS细胞株购自中国科学院细胞库。在完全培养液中（89% RPMI-1640培养基＋10%胎牛血清＋1%双抗）进行细胞培养，并置于37 ℃，5% CO2的恒温培养箱中，2～3 d换液传代。八宝丹购自厦门中药厂有限公司（批号：180901）。

1.2 实验试剂 RPMI-1640培养基、胎牛血清均购自美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：11875119、10099141c；消化胰酶、青霉素/链霉素双抗液（上海碧云天生物技术有限公司，批号：c0202、030311b）；PBS缓冲液（美国Hyclone公司，批号：sh30256.01）；CCK8试剂盒（亚科因公司，批号：kta1020）；Annexin V/PI流式细胞术检测试剂盒（艾博抗公司，批号：KTA0004）；CyclinD1（福州精锐生物公司，批号：ma139546）；MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2、GAPDH抗体（美国Abcam公司，批号：ab131517、ab17942、ab16573、ab97627）；二抗（美国Cell Signaling 公司，批号：7076）。

1.3 实验仪器 恒温细胞培养箱和酶标检测仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；超净工作台（苏州净化设备公司）；电子显微镜（德国Leica公司）；ABI 7500 PCR仪（美国应用生物系统公司）；化学发光成像仪（美国Bio-Rad Laboratories公司）。

2 实验方法

2.1 八宝丹药液配制 八宝丹充分溶解于PBS溶液，配制成20 mg/mL的药液，使用超声仪器助溶2 h，高压灭菌待药液彻底混匀后，将药液分装置于-20 ℃冰箱储存备用。

2.2 细胞培养 将U2OS细胞在25 cm2细胞培养瓶中使用完全培养液（89% RPMI-1640培养基＋10%胎牛血清＋1%双抗）培养，待细胞长至80%以上即传代接种，以0.2×105/mL的密度接种于96孔板。

2.3 分组干预 实验分为对照组和八宝丹不同浓度组（BBD-0.5 mg/mL组、BBD-1.0 mg/mL组、BBD-1.5 mg/mL组），每组细胞均设置5个复孔，分别于0、24、48 h进行细胞计数分析。

2.4 CCK8法检测八宝丹对U2OS细胞增殖的影响 八宝丹不同浓度组细胞分别于0、24、48 h加入CCK8溶液10 µL/孔，并继续培养4 h后于450 nm波长的酶标仪中检测细胞OD值。以只加完全培养基的孔OD值作为空白对照，以0 h测定的细胞OD值作为对照组。

细胞增殖率＝（加药组OD值－空白对照组OD值）/（对照组OD值－空白对照组OD值）×100%

2.5 流式细胞术检测八宝丹对U2OS细胞凋亡的影响 U2OS细胞以1×106/mL的密度接种于6孔板，待细胞已完全融合后，PBS清洗，每孔加入不含EDTA的胰酶消化，DMEM中和，离心，收集细胞沉淀。100 µL 1×Binding Buffer重悬细胞后，加入5 µL Annexin V-AbFlourTM647和2 µL PI，室温避光孵育后加入400 µL 1×Binding Buffer混匀，样本保持放在冰上，30 min内流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.6 qPCR法检测八宝丹对U2OS细胞中Ras、Raf mRNA表达的影响 U2OS细胞以密度为0.8×105个/mL接种于6孔板，待细胞贴壁后继续培养24 h收集细胞，用Trizol法从细胞中提取总RNA。利用PrimeScript RT试剂盒从500 ng的RNA中生成cDNA。取2 µL的cDNA用ABI 7500 Fast Real-Time PCR系统进行PCR扩增反应。qPCR的条件为：预变性（95 ℃ 10 min）、变性（95 ℃ 15 s）、退火和延伸（60 ℃60 s），共40个循环。以GAPDH作为内部对照。mRNA水平表示为：2-ΔΔCt（以Ct为周期阈值），其中ΔCt＝［Ct（Target gene）－Ct（GAPDH）］。引物序列Ras-F：AGTACGTGAGATTCGGCAGC；Ras-R：CACACACT TGCAGCTCATGCC。Raf-F：CCGTCCCGCTGAATACTA CC；Raf-R：ACTGACTGAATCGTGCCGTT。GAPDHF：ACAACTTTGGTATGGGAAGG；GAPDH-R：GCCA TCACGCCACAGTTTC。

2.7 Western blot法检测八宝丹对U2OS细胞中ERK通路相关蛋白CyclinD、MEK1/2、p-ERK1/2、ERK1/2表达蛋白量的影响 将U2OS细胞以密度为0.8×105个/mL接种于6孔板，待细胞贴壁后继续培养24 h收集细胞，RIPA裂解液提取总蛋白，BCA定量法测定各组蛋白浓度，同时使用5×SDS蛋白变性后用于后续操作。使用SDS-PAGE电泳法进行凝胶电泳，以蛋白量50 µg定量测定各组上样体积，电泳结束后将蛋白转移到PVDF膜，经完全封闭液封闭1 h后加入一抗CyclinD1（1∶1 000）、MEK1/2（1∶500）、ERK/2（1∶1 000）、p-ERK/2（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）置于4 ℃冷冻室中孵育。隔夜后吸出一抗并洗净条带，采用相对应的兔二抗（1∶10 000）继续孵育2 h后，洗净二抗后进行显影，并用凝胶成像系统进行条带分析。

2.8 统计学方法 采用SPSS 23.0软件进行数据处理。计量资料服从正态分布以（）表示，组内比较采用配对样本t检验，组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结 果

3.1 八宝丹对U2OS细胞增殖的影响 使用0.5、1.0、1.5 mg/mL的八宝丹分别干预U2OS细胞。在干预24 h（A）和48 h（B）时，与对照组比较，不同浓度的八宝丹对U2OS细胞的增殖均有不同程度的抑制作用，且呈剂量依赖（P＜0.05）；其中干预48 h对细胞增殖的抑制作用更明显，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 八宝丹对U2OS细胞增殖的影响

3.2 八宝丹对U2OS细胞凋亡的影响 与对照组比较，0.5、1.0、1.5 mg/mL的八宝丹干预均能显著抑制U2OS细胞的凋亡（P＜0.05），见图2。

图2 BBD对U2OS细胞凋亡的影响

3.3 八宝丹对U2OS细胞中Ras、Raf mRNA表达水平的影响 与对照组比较，0.5、1.0、1.5 mg/mL剂量组的八宝丹均能显著下调U2OS细胞中的Ras和Raf mRNA表达水平（P＜0.05），见图3。

图3 BBD对U2OS细胞中Ras、Raf mRNA表达水平的影响

3.4 八宝丹对U2OS细胞中ERK1/2通路上相关蛋白表达量的影响 0.5、1.0、1.5 mg/mL的八宝丹均能下调CyclinD1、MEK1/2的蛋白表达量，同时降低p-ERK1/2与ERK1/2蛋白的比率（P＜0.05），见图4。

图4 BBD对ERK1/2通路上相关蛋白表达比较

4 讨 论

骨肉瘤是严重影响青壮年身体健康的恶性肿瘤，在原发性骨恶性肿瘤中发病率最高，约占所有癌症的0.3%，该病病情进展迅速，恶性程度高［1］。目前临床上主要以辅助化疗和外科根治性手术为主要治疗方法，使患者5年生存率有所提高［18］。然而，由于本病早期肺转移的发生率高，临床上对于其转移癌的疗效则欠佳［19］。目前所采取的治疗措施可以延长患者的生命，但骨肉瘤快速的增长率仍是导致患者生存率较低的主要原因之一，成为该疾病临床亟须解决的一个棘手问题［20］。

八宝丹是中药二级保护品种，不仅可以提高患者的免疫力，还对一些肿瘤细胞的增殖及迁移能力有一定的影响［21］。然而，八宝丹对骨肉瘤细胞的抑制作用和相关机制的报道较少。因此，本课题旨在从细胞层面观察八宝丹抑制骨肉瘤的增殖、促进其凋亡的作用，并进一步探讨其作用机制。在观察八宝丹抑制骨肉瘤细胞增殖的作用方面，选取了U2OS细胞株采用不同浓度的八宝丹对其进行干预处理。研究发现八宝丹在低剂量0.5 mg/mL时即可对细胞产生生长抑制作用，这与之前报道的文献结果相一致［21］。中、高剂量组的八宝丹在48 h抑制骨肉瘤细胞的增殖效果更为明显。课题组进一步探讨了八宝丹对U2OS细胞凋亡的影响，结果显示八宝丹在抑制骨肉瘤细胞凋亡的作用方面效果显著，且呈现出明显的浓度依赖性。由此可见，八宝丹可能是通过抑制骨肉瘤细胞增殖，同时促进细胞凋亡的双重作用，从而达到延缓骨肉瘤生长的目的。

课题组对八宝丹抗骨肉瘤细胞生长的机制进行了进一步的探讨。ERK1/2信号通路是MAPK信号转导通路家族的一条主要通路，在近年来的研究中，多种ERK1/2通路上的蛋白被发现［22］，这些蛋白的异常活化或表达与肿瘤发生、发展密切关系。一方面ERK1/2通过促进肿瘤细胞分裂、增殖，而导致骨肉瘤细胞的恶性增殖特质，另一方面也可通过直接或间接的方式抑制肿瘤细胞的凋亡［23］。目前，多种针对该信号通路的激酶抑制剂已经进入临床研究阶段［24］，提示抑制ERK1/2信号通路对抑制肿瘤的生长极具意义。活化的ERK1/2激酶移位到细胞核，其可激活或灭活信号转导途径的关键效应因子以及重要的转录因子，并能调节细胞周期相关因子和凋亡因子的表达［25］。因此，本研究对ERK1/2信号通路关键的Ras和Raf基因进行验证。实验结果发现，0.5 mg/mL的八宝丹即可拮抗Ras和Raf基因的表达，1、1.5 mg/mL八宝丹的作用更加明显，提示八宝丹在ERK1/2通路上游即具有一定的抑制效应。Western blot结果进一步表明八宝丹可以抑制ERK1/2通路上CyclinD1和MEK1/2蛋白的表达水平，并且降低ERK1/2与p-ERK1/2蛋白比率，提示八宝丹在抑制骨肉瘤生长时对ERK1/2信号通路具有显著的抑制作用。

综上，八宝丹抗骨肉瘤细胞生长的作用是通过抑制ERK1/2信号通路实现的，为后续八宝丹应用于骨肉瘤治疗的相关临床研究提供实验依据。