紫白膏对大鼠肛周创面愈合及皮肤组织IL-1β、TNF-α表达的影响

李阳，汪昭楚，王菁，黄鸿铃，赵晨孜，刘纯香，石荣*

（1.福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 350004；2.陈民藩国医大师传承工作室，福建 福州 350004）

由于肛门特殊的生理功能和解剖位置，肛肠手术多采用开放性创面，术后愈合时间较长；加之排便刺激及肠道菌群的影响，术后创面易出现感染、水肿、渗出增多等情况，从而增加患者的痛苦和住院时间。紫白膏是国医大师陈民藩教授创立的肛肠科制剂，团队前期研究表明紫白膏可下调NF-κB mRNA、1L-6的表达，有效促进创面愈合［1-3］。本研究采用动物实验，通过模拟大鼠肛周术后皮肤创面模型，观察大鼠背部皮肤创面组织在紫白膏作用下，其白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平的变化，探讨紫白膏在创面愈合过程的作用机制。

1 材 料

1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠90只，8周龄，体质量（250±25 g），由杭州医学院动物实验室提供，生产许可证号为SCXK（浙）2019-0002，大鼠于动物实验室检疫间适应性喂养3 d，使用许可证号为SYXK（闽）2022-0002。本实验严格按照动物实验规范进行（动物伦理批号：FJABR2022052001）。

1.2 实验药物与主要试剂 紫白膏（福建中医药大学附属人民医院院内制剂，由大黄、紫草、白及、煅石膏、冰片组成，批号：220209）；0.9%氯化钠注射液（福州海王福药制药公司，批号：200218A24）；75%乙醇消毒液（山东利尔康公司，批号：210901）；水合氯醛（上海阿拉丁生化科技公司，批号：K913111）；医用纱布块（南昌意尔康公司，批号：20220316）；大青叶抑菌液（河南杰东药业公司，批号：19061301）；莫匹罗星软膏（中美史克公司，批号：PD38）；凡士林（浙江振德医疗公司，批号：202210231A），混合痔患者术后新鲜粪便。大鼠IL-1β ELISA检测试剂盒（江苏酶免实业有限公司，批号：MM-0047R1）、大鼠TNF-α ELISA检测试剂盒（江苏酶免实业有限公司，批号：MM-0181R1）。

1.3 主要实验仪器 酶标仪、化学发光成像系统（美国伯乐公司）。

2 方 法

2.1 实验方法

2.1.1 肛周创面造模及评价 参照文献［3］对大鼠进行肛周创面造模。选用腹腔注射麻醉，每只大鼠使用3.5 mL/kg的10%水合氯醛。局部备皮，常规消毒后，以大鼠背部为圆心，直径约为2 cm，做一圆形切口，以先皮肤全层，后皮下浅筋膜直至肌层的顺序剪开，创面充分止血后以油纱、敷料、胶带固定。空白组每次换药前不滴加粪液，仅用生理盐水纱条湿敷。其余各干预组每次换药前0.5 h均在创面上滴加粪液1 mL（混合痔患者术后的新鲜粪便10 g，加生理盐水5 mL，混匀，离心，取上清液，现配现用），大鼠创面见红肿隆起，超过创缘水平面，并伴有炎症渗出即为造模成功。

2.1.2 动物分组及给药 90只清洁级SD大鼠适应性喂养3 d，按随机数字表法分为空白组、模型组、凡士林组、紫白膏组、大青叶组和莫匹罗星软膏组，每组15只。除空白组外，各组大鼠均予模拟肛周术后皮肤创面造模。创面常规清创后，空白组、模型组均予生理盐水纱条湿敷，凡士林组、紫白膏组、大青叶组及莫匹罗星软膏组分别予对应药物干预，使用棉签蘸取少量药物完整、均匀地涂覆创面，层厚约1 mm。各组干预后予清洁敷料覆盖，外用胶布固定。每日以相同的方法换药1次。

2.1.3 创面组织标本采集 各组分别于治疗后第3、7、14 d腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，以背部皮肤创面为中心沿创缘剪取组织标本，分类标记后于-80 ℃环境冻存，备EILSA检测。

2.2 大鼠创面愈合情况观察 观察治疗后第3、7、14 d创面愈合率及创面愈合面积。采用心电图网格纸（1小格1 mm）测量创面面积大小，并计算创面愈合率。创面愈合率的计算公式如下：

创面愈合率＝（原创面面积－现创面面积）/原创面面积×100%

2.3 大鼠创面组织的IL-1β、TNF-α含量测定 采用ELISA法分别检测大鼠肛周模型创面组织的IL-1β、TNF-α含量，大致步骤如下：冲洗、剪碎及研磨组织后得到5 000 g匀浆液，予离心后取上清液备检测。标准品孔各加不同浓度的标准品50 µL；样本孔中加入待测样本50 µL；空白孔不加。标准品孔和样本孔中加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100 µL，用封板膜封住反应孔，恒温箱温育60 min。弃液，重复洗板5次。加入反应底物A、B，37 ℃避光孵育15 min。加入终止液50 µL，15 min内于450 nm波长处测定各孔的OD值。

2.4 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布采用（）描述，创面愈合率比较采用单因素方差分析，组间比较采用非参数检验。P＜0.05则为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 大鼠创面愈合结果 5组大鼠创面外观愈合情况，见图1。5组大鼠创面愈合率随着治疗天数的增加而改善。实验结果表明，与模型组相比，治疗后第3、7 d各组之间创面愈合率差异无统计学意义。治疗后第14 d，莫匹罗星软膏组与模型组创面愈合率差异无统计学意义（P＞0.05）；凡士林组、紫白膏组、大青叶组的创面愈合率与模型组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图2。

表1 5组大鼠创面面积不同时间点比较（）mm2

表1 5组大鼠创面面积不同时间点比较（）mm2

注：与模型同时间点组比较，1） P＜0.05。

治疗第14天54.60±5.18 48.68±6.261）43.04±5.571）46.74±8.451）52.50±11.51模型组凡士林组紫白膏组大青叶组莫匹罗星软膏组15 15 15 15 15 314.56±3.35 312.46±4.70 313.45±3.24 309.73±4.35 313.53±3.07 270.66±11.88 269.97±14.34 267.75±12.36 264.54±15.66 268.84±5.43 198.36±11.41 202.39±12.64 201.32±4.96 193.45±14.29 197.39±15.07组别n 原始面积治疗第3天治疗第7天

图1 5组大鼠不同时间点创面外观比较

图2 5组大鼠不同时间点创面愈合率比较

3.2 6组大鼠创面组织治疗不同时间点IL-1β、TNF-α含量比较 见表2～表3。

表2 6组大鼠治疗不同时间点创面组织IL-1β含量比较（） pg/mL

表2 6组大鼠治疗不同时间点创面组织IL-1β含量比较（） pg/mL

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05；与紫白膏组比较，3） P＜0.05。

第14天16.52±0.37 20.13±0.411）20.00±0.633）17.11±0.552）19.04±0.813）18.95±0.682）3）组别空白组模型组凡士林组紫白膏组大青叶组莫匹罗星软膏组n 15 15 15 15 15 15第3天16.22±0.92 21.33±1.221）21.08±0.65 19.77±1.10 20.68±0.76 20.15±0.83第7天16.93±0.55 20.94±1.301）20.26±0.87 18.85±0.812）20.11±0.89 19.72±1.06

表3 6组大鼠治疗不同时间点创面组织TNF-α含量比较（） pg/mL

表3 6组大鼠治疗不同时间点创面组织TNF-α含量比较（） pg/mL

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05；与凡士林组比较，3） P＜0.05。

第14天79.62±2.00 93.17±2.831）89.02±0.95 80.60±2.642）3）84.88±2.132）85.85±5.592）组别空白组模型组凡士林组紫白膏组大青叶组莫匹罗星软膏组n 15 15 15 15 15 15第3天77.48±3.56 90.10±1.311）92.55±3.35 87.99±2.70 88.42±2.96 88.61±3.26第7天78.57±2.89 93.59±4.211）90.52±3.93 83.44±2.642）87.37±2.932）87.78±1.77

4 讨 论

创面愈合是一个复杂的过程，从凝血开始，经坏死组织、异物和细菌的清除等一系列过程，以新生组织形成并填补伤口缺损结束，包括止血、消炎、生长、再上皮化和重构等不同阶段，其中涉及多种细胞和炎性因子的参与［4-5］。LV等［6］研究发现，六合丹在兔创面愈合过程中，特异性地抑制IL-1β的表达，减少感染伤口炎症因子的释放，可促进感染伤口的愈合。TNF-α也是参与炎症反应的一个重要细胞因子，在创面分泌物中TNF-α水平持续增高，高渗应激致细胞凋亡和坏死，细胞周期持续阻滞，促使创面发生炎症反应，延缓创面愈合［7］。姚昶等［8］研究也表明疮灵液载入胶原对慢性创面的促愈作用与TNF-α水平的下调有关。

中医外治法在促进创面治疗方面具有作用直接、疗效好、成本低、患者易接受等优点。紫白膏是国医大师陈民藩教授运用“酸涩收敛”理论研制的中药复方制剂，在临床中广泛应用于治疗痔、瘘、裂等肛肠疾病以及术后的治疗［9-10］。紫白膏以大黄、紫草为君，白及、煅石膏为臣，佐以冰片，其中大黄清热泻火兼以除湿祛瘀，紫草清热解毒凉血，治疗热邪迫血溢于脉外，起祛陈化新、消肿止痛之效；石膏泻火，热去则血宁，辅助止血的同时又可敛疮生肌，与白及同用能收能止，使疮可敛、血得安，助君药清热泻火生肌，加速伤口愈合；冰片能消结散肿，增强清热泻火之效。诸药合用，既能清热解毒，消肿止痛，又能凉血止血，促进创面愈合。

创面造模后受粪便菌群的影响，易加重炎症反应，影响创面愈合。大青叶抑菌液为中药提取物的复方制剂，主要针对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌谱，是体外抑菌的常用药物［11］，而莫匹罗星软膏对革兰氏阳性菌有更强的活性［12］。研究表明，肛周疾病的菌群分布既有革兰氏阴性菌又有革兰氏阳性菌［13］，故本研究设置肛肠科常用的大青叶抑菌液、莫匹罗星软膏和紫白膏作为主要干预药物，对比不同抑菌条件下的疗效差异。

本研究结果表明，在治疗第14天，紫白膏组、大青叶组、凡士林组的创面愈合率明显高于模型组（P＜0.05），凡士林组的促进愈合作用很可能是凡士林对创面的保护作用，减少了创面的受污染程度；莫匹罗星软膏促进愈合作用相对不明显，可能与其特殊的阳性抗菌谱有关。ELISA实验表明，大鼠造模后IL-1β及TNF-α的含量均明显升高（P＜0.05），证明肛肠疾病术后，肛周环境更利于细菌的生长繁殖，从而引起更为严重的炎症反应。治疗第7天，与模型组比较，紫白膏组大鼠创面组织IL-1β含量明显下降，紫白膏组、大青叶组大鼠创面组织TNF-α含量明显下降（P＜0.05）。治疗第14天，与模型组比较，紫白膏组大鼠创面组织的IL-1β含量明显下降（P＜0.05），紫白膏组、大青叶组、莫匹罗星软膏组大鼠创面组织的TNF-α含量明显下降（P＜0.05）。以上结果表明，大青叶的促愈机制可能与抑菌作用下TNF-α的明显下调有关，而紫白膏对IL-1β与TNF-α均有明显的调控作用，且这2种炎性因子含量更低。

综上所述，紫白膏能明显促进大鼠创面愈合，减少创面组织IL-1β和TNF-α的水平，减轻创面炎性细胞浸润。在今后的研究中，需要进一步明确紫白膏对肛周创面的抗炎、抑菌及促生长效应，以扩大其临床应用。