铁皮石斛饮料杀菌工艺研制及品质分析

王再花，叶广英，曾灿彪，叶庆生，黄秀红

（1广东省农业科学院环境园艺研究所/广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室，广州 510640；2华南师范大学生命科学学院，广州 510631）

0 引言

铁皮石斛为国内名贵中药材和保健食材。铁皮石斛作为药食同源植物被国家药监局批准后，在云南、贵州、浙江、福建、广西、广东等地作为食品逐渐被开发，制成石斛茶、饮料、浸膏等百余种产品，其中的鲜榨饮料因方便快捷成为企业和农户的主要加工销售产品。因铁皮石斛鲜榨汁保质期短，不适于市场流通，一些科研工作者开始饮料的研制，如石斛乳酸饮料[1]、石斛山楂复配保健饮料[2]；经石斛提取制作饮料，如将金钗石斛中有效成分生物碱制成饮料[3]，将金钗石斛的乙醇浸提滤液作为主剂，其他成分含有维生素C、柠檬酸、硫酸钠、低聚果糖、白砂糖、蛋白糖、乙基麦芽酚和水；此外还研发出了霍山石斛运动抗疲劳饮料[4]、铁皮石斛苹果复配饮料[5]、铁皮石斛雪梨保健饮料[6]。

高压技术在食品加工过程中能够灭活有害和腐败的生物体，延长产品保质期，同时对营养素和食品的新鲜品质属性影响最小，是食品加工的主要杀菌途径之一[7-8]。但有关铁皮石斛的杀菌工艺及贮藏稳定性的研究报道比较少。李春柳等[9]报道DMDC对生鲜食品特定腐败菌荧光假单胞菌、隆德假单胞菌的浮游菌和被膜菌具有良好的杀菌效果，并且对桑果汁、荔枝酒、葡萄酒、胡柚汁等具有一定的杀菌效果[10]。乳酸链球菌素(Nisin)因对李斯特氏菌、梭状芽胞杆菌、葡萄球菌等有抗菌作用且对人安全，已被美国食品药品监管局批准用作食品添加剂[11]，在食品加工中应用日渐广泛。例如发酵蓝莓酒酒精度随着Nisin 加入量的增大呈极显著地增大[12]，Nisin 与超高压结合处理对Escherichia coliO157:H7产生协同杀菌效果[13]。而DMDC联合Nisin在荔枝汁杀菌中有良好的效果[14-15]，但生物性杀菌剂Nisin和DMDC的应用报道不多。

多糖是铁皮石斛的主要活性成分之一[16]，其含量是铁皮石斛质量评价的主要指标，具有提高免疫力[17]、护肝[18]、抗肿瘤[19-20]、抗氧化[21]、降血糖[22]等多种功效。笔者通过比较不同杀菌方式多糖、总酚等物质的变化，探讨铁皮石斛饮料存储期的质量变化，为铁皮石斛饮品的加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

铁皮石斛在广东省农业科学院环境园艺研究所白云基地(23°23′40″N，113°26′46″E)栽培和采集，为10月取材的铁皮石斛1.5年新鲜茎。经环境园艺研究所徐晔春研究员鉴定为兰科石斛属铁皮石斛(Dendrobium officinale)，存放广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室。

1.2 试剂

葡萄糖(α-D-glucopyranose，≥99.9%)，购自Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司；没食子酸(≥99.0%)，购自上海麦克林生物科技有限公司；硫酸为优级纯，购自广州试剂厂；DMDC，购自德国朗盛公司；Nisin（食品级），购自浙江新银象生物工程有限公司。其他化学试剂为分析纯。

1.3 仪器与设备

UV-2405紫外-可见分光光度计，日本Shimadzu公司；UltraScan VIS型全自动色差仪，美国HunterLab公司。

1.4 试验方法

1.4.1 铁皮石斛饮料制作取铁皮石斛新鲜茎，料液比1:30(g:g)。饮料制作过程为铁皮石斛鲜茎→粉碎→过滤→加热→灌装→灭菌→成品。

1.4.2 杀菌工艺设置7种不同杀菌方式对铁皮石斛饮料进行灭菌处理，M1～M4 处理灌装玻璃瓶，260 mL/瓶。M5～M7处理饮料100℃煮沸灌装，倒置排气。

M1为121℃高温高压灭菌5 min；M2为121℃高温高压灭菌10 min；M3为121℃高温高压灭菌15 min；M4为121℃高温高压灭菌20 min；M5为添加0.2 g/kg天然生物活性抗菌肽乳酸链球菌素(Nisin)，100℃煮沸；M6为添加饮料杀菌剂二甲基二碳酸盐(DMDC)0.25 g/kg，100℃煮沸；M7 为添加0.25 g/kg DMDC 和0.2 g/kg Nisin，100℃煮沸。分别测定灭菌当天、在37℃保温贮藏7 d与21 d的饮料的菌落总数，从而初步确定有效的杀菌方式。

1.4.3 铁皮石斛稳定性的测定通过有效灭菌处理的铁皮石斛饮料在(25±1)℃的培养箱中进行16 周贮藏试验，每隔1周测定一次菌落总数、多糖含量、总酚含量、pH及色差度，分析其在不同灭菌条件下贮藏期内的稳定性。

（1）多糖含量采用改良的苯酚-硫酸法测定[23]。

①葡萄糖标准曲线的确定。精密称定烘干至恒重的无水葡萄糖对照品0.1 g，用蒸馏水定容至100 mL，取9 mL 溶液至100 mL 容量瓶中加蒸馏水定容至刻度，即得每1 mL含90µg的溶液。

②标准曲线的确定。精密量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于15 mL 具塞试管中，各加蒸馏水补至1.0 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，再精密加浓硫酸5 mL，摇匀，置沸水浴中加热5 min，取出，置冰浴中冷却，以相同体积蒸馏水为空白，用紫外-可见分光光度计在485 nm 的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线。

③供试品溶液的制备及测定。取样品粉末（过三号筛）约0.3 g，精密称定，加水100 mL(V1)，加热回流2 h，放冷，转移至100 mL容量瓶中，补水至刻度，摇匀，过滤，精密量取过滤液2 mL(V2)，置于15 mL离心管中，精密加入无水乙醇8 mL，摇匀，冷藏1 h，取出，5000 r/min离心5 min，弃上清液，沉淀加80%乙醇洗涤2次，每次8 mL，弃上清液，沉淀加热水溶解，转移至10 mL(V3)容量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，即得。

精密量取供试品溶液0.3 mL(V4)，蒸馏水0.7 mL，置于15 mL具塞试管中，照标准曲线确定项下的方法，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的量，计算如式(1)。

式中，C为根据标准曲线得到的多糖含量，V1为样品提取时定容体积，V2为沉淀多糖时取液量，V3为测定多糖时定容体积，V4为样品测定时取样液体积，m为样品称量质量。

（2）采用福林酚比色法测定总酚含量。

①标准曲线的确定。精确称取干燥至恒重的没食子酸对照品5 mg，用蒸馏水溶解并定容至25 mL棕色量瓶中，即得0.2 mg/mL 对照品溶液。精密量取标准溶液0.00、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL，分别置于15 mL 试管中，加入福林试剂0.5 mL，充分摇匀，再加入20%NaCO3溶液1.5 mL，摇匀，定容至10 mL，摇匀，50℃水浴加热10 min，以蒸馏水为空白，于765 nm 处测定吸光值。

②供试品溶液的制备及测定。精密称取0.3 g(m)样品置于100 mL具塞锥形瓶，加50%乙醇50 mL(V1)，称定质量，于80℃水浴回流1 h后取出冷却，再称重，用50%乙醇补足减失质量，过滤，续滤液作为供试品。量取0.5 mL(V2)待测液，按照标准曲线确定项下方法测定其吸光值，代入式(2)计算其总酚含量。

式中，C为根据标准曲线计算得到的芦丁含量，V1为提取液体积，V2为测定时提取液的体积，m为样品质量。

1.4.4 菌落总数的测定参照《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》(GB/T 4789.2—2022)，在无菌超净工作台上，取1 mL 饮料原液和10 倍的稀释液分别加入灭菌培养皿内，试验设置3个重复，每皿内加入适量营养琼脂，冷却凝固后将其密封并倒置于(36±1)℃的培养箱中培养，24 h后观察计数。

1.4.5 色差度测定采用UltraScan VIS 型全自动色差仪（总透射模式）对铁皮石斛饮料的色泽进行测定，色泽稳定性结果以L、a和b值表示。

1.4.6 数据统计与分析 所有试验结果数据均采用SPSS 19.0进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 杀菌方式筛选

铁皮石斛饮料营养丰富，pH 5.28，属于中性饮料，微生物更容易生长繁殖，一般的巴氏杀菌达不到食品杀菌要求，因此探究杀菌工艺是必不可少的。由于致病性O157大肠杆菌在75℃、1 min 时即可被杀死，因此对于本试验7 种杀菌方式的筛选，可以只检测菌落总数而不检测大肠菌群。

石斛饮料装瓶灭菌后，取各灭菌条件下的6 瓶饮料置于37℃培养箱中放置7、21 d，再用培养基于37℃培养观察细菌菌落总数。由表1可知，7种杀菌方式在灭菌当天的菌落总数均为0 cfu/mL，37℃贮藏7、21 d后，M6 处理的饮料中菌落总数均超过了100 cfu/mL，其他灭菌方法能达到石斛饮料无菌的要求。

表1 不同杀菌方式的菌落总数 cfu/mL

2.2 不同灭菌条件下铁皮石斛饮料贮藏期稳定性研究

采用能有效杀灭铁皮石斛饮料中微生物的灭菌处理M1～M4、M5、M7在(25±1)℃的培养箱中进行贮藏试验，由于M1处理的铁皮石斛饮料在贮藏5～16周期间，每次至少出现3管（总共6管）饮料腐败变质；M2处理也存在部分腐败变质现象，所以将此2 种方法剔除；M4处理尽管不变质，但杀菌方式比M3时间长5 min，考虑到灭菌时间过长会降低营养成分，将此法剔除。因此，最终分别测定铁皮石斛饮料在M3、M5、M7处理下贮藏0～16 周后的菌落总数、多糖含量、总酚含量、pH及色差度，分析其在不同灭菌条件下贮藏期内的稳定性。

2.3 铁皮石斛饮料贮藏期菌落总数的变化

分别在铁皮石斛饮料贮藏过程中进行定期菌落总数的测定。在灭菌当天，M3 处理的饮料菌落总数为0 cfu/mL，M5和M7处理则为10 cfu/mL，M5、M7处理的饮料分别在贮藏1、2 周后达到0 cfu/mL，说明生物杀菌剂在贮藏过程中持续起作用。在贮藏过程中，3种灭菌方式的饮料菌落总数均达到了《果、蔬饮料卫生食品安全国家标准饮料》(GB 7101—2022)规定的≤100 cfu/mL，说明3种灭菌处理的铁皮石斛饮料在贮藏期内可以保持良好的品质，不会发生腐败变质。

2.4 铁皮石斛饮料贮藏期多糖含量的变化

由表2可知，在16周的贮藏期间，3种杀菌条件下的铁皮石斛饮料多糖含量均明显下降，在杀菌0 d，相对铁皮石斛饮料灭菌前即原液的多糖含量，M3 处理的多糖含量下降最多，达36 mg/100 mL，M5 和M7 下降较少，约13 mg/100 mL。在贮藏1周后，M5和M7处理的多糖含量几乎不变，2 周后出现明显下降，而M3的多糖含量在灭菌后下降明显，在贮藏11周期间下降不明显，这可能与M3杀菌条件过于剧烈，M5和M7中的生物杀菌剂Nisin、DMDC在贮藏期间缓慢起作用有关。灭菌当天和贮藏1 周，M5 的多糖含量显著高于M3；灭菌当天和贮藏2周内，M7多糖含量也显著高于M3。而随着贮藏时间延长约16 周，M5 和M7 杀菌条件下其饮料多糖含量均出现明显下降。

表2 不同灭菌条件铁皮石斛饮料多糖含量变化mg/100 mL

2.5 铁皮石斛饮料贮藏期总酚含量的变化

由表3可知，3种杀菌方式铁皮石斛饮料灭菌后的总酚含量均下降，比灭菌前的原液减少约0.50 mg/100 mL，均具有显著差异，这可能与多酚类物质在光照和高温下易分解有关。随着铁皮石斛饮料贮藏时间的延长，3种杀菌方式总酚含量变化的趋势大致相同，虽然贮藏期间会出现小波动，但总体上没有出现明显下降，说明铁皮石斛饮料中酚类物质在16周贮藏期间基本没有发生氧化等化学反应，而贮藏期间总酚含量的小波动可能与试验误差有关。在同一贮藏期内，3种杀菌方式的总酚含量中，以M3、M7为佳，大于M5的总体趋势。

表3 不同灭菌条件铁皮石斛饮料总酚含量变化mg/100 mL

2.6 铁皮石斛饮料贮藏期pH的变化

图1表明，3种灭菌方式的铁皮石斛饮料在灭菌前后的pH几乎不变，均在5.30左右。随着贮藏时间的延长，M3、M5 处理灭菌条件下铁皮石斛饮料的pH 基本不变，且两者pH 几乎相等。M7处理下的铁皮石斛饮料在贮藏1 周后pH 发生骤变，上升到6.46，在之后贮藏期间几乎维持在6.50左右。

图1 不同灭菌条件铁皮石斛饮料贮藏过程中pH变化

2.7 铁皮石斛饮料贮藏期色泽稳定性

在色度测定中，L表示亮度指数，L值越大，亮度越大；a表示有色物质的红绿色度偏向，正值越大，偏向红色的程度越大，负值绝对值越大，偏向绿色的程度越大；b表示有色物质的黄蓝色度偏向，正值越大，偏向黄色的程度越大，负值绝对值越大，偏向蓝色的程度越大。

由图2～4可知，3种灭菌条件下的铁皮石斛饮料在灭菌前后色泽变化均明显，L值、b值均下降，说明灭菌后的铁皮石斛饮料的亮度、黄色程度均减小，a值绝对值减小，叶绿素被破坏，饮料绿色程度下降，与外观现象一致，饮料杀菌后绿色明显变淡。3 种杀菌方式的温度均≥100℃，杀菌后的色泽与原液的对比结果表明温度对饮料的色泽影响明显。在16 周贮藏期间，M3杀菌条件下的铁皮石斛饮料的色泽亮度L值在缓慢上升，在后期则趋于平稳趋势，a值和b值均处于变化平缓趋势。相对于灭菌当天，M5处理下的饮料贮藏2周后色泽L值有增加趋势，a值基本不变，b值在贮藏1周后出现了明显下降，在2～16 周期间基本不变，期间出现的2次大波动，可能与样品不均匀有关。M7杀菌方式的铁皮石斛饮料中a值变化不大，其L值、b值波动较大，可能与M7 处理饮料pH 在贮藏期间上升有关，出现饮料亮度和黄色程度值时高时低。

图2 不同灭菌条件铁皮石斛饮料L值贮藏过程中的变化趋势

图3 不同灭菌条件铁皮石斛饮料a值贮藏过程中的变化趋势

图4 不同灭菌条件铁皮石斛饮料b值贮藏过程中的变化趋势

总体而言，与原液相比，铁皮石斛饮料杀菌后L值、a绝对值和b值均减小；从总的趋势看，在贮藏期间，L值有较小的增加趋势，a值和b值基本不变，外观色泽没有发生很大的变化。可见，在25℃贮藏过程中铁皮石斛饮料能保持良好的色泽稳定性。

3 结论与讨论

多糖是石斛茎的主要活性成分之一，具有增强免疫力、降血压、降血糖、抗氧化及抗肿瘤等多种药效[24-27]。饮料的杀菌工艺恰当与否，不仅影响产品的保质期，而且影响产品的质量。杀菌技术有热力杀菌技术和非热力杀菌技术2类。热力杀菌中的巴氏杀菌是饮料生产工业上最普遍的杀菌方法，因为大多数果蔬饮料为pH＜4.6的酸性饮料[28]，乳饮料线生产杀菌型浓缩酸奶则主要采用温度90～95℃、30 s巴氏杀菌[29]。铁皮石斛饮料的pH 5.28，为中性饮料，巴氏杀菌不能使铁皮石斛饮料达到商业杀菌标准，故本研究采用保温试验法筛选出有效的灭菌方法。在研究火龙果果汁饮料以及银杏饮料制备工艺的杀菌工艺时，均采用保温试验进行筛选[30]，霍山石斛运动饮料制作也选用90℃、杀菌20 min[4]，与研究采用的高温高压灭菌方法类似。

采用能有效杀灭铁皮石斛饮料中微生物的灭菌处理M1、M3、M5、M7 进行了16 周贮藏试验，在贮藏过程中，发现M1 在贮藏第5 周后菌落总数不稳定，菌落总数检测中总是出现饮料腐败变质。可见，仅以保温试验法筛选最佳杀菌工艺的方式不妥。为了确保饮料产品在货架期内的微生物都符合商业杀菌标准，饮料杀菌工艺应该在灭菌条件初步筛选后进行至少16 周贮藏试验。

何磊[3]制作金钗石斛饮料采用的杀菌方式为121℃、15 min；铁皮石斛原球茎饮料在纳他霉素、Nisin 和壳聚糖3 种复合生物保鲜剂共同作用下达到商业杀菌标准[31]；石斛枸杞菊花复合饮料在90℃水浴锅中灭菌30 min，其菌落总数还是≥100 cfu/g；丁勇[5]在制作铁皮石斛苹果复合饮料，加热90～95℃、灭菌15～20 min后，室温储藏2个月后检测菌落总数≤3 cfu/mL；李蕾等[6]于115℃灭菌15 min 的铁皮石斛雪梨饮料细菌总数≤50 cfu/mL，大肠杆菌≤3 cfu/mL。本试验筛选出M3、M5、M7 这3 种杀菌条件，可见，石斛饮料在高温或生物杀菌剂处理下具有较长的货架期。

铁皮石斛饮料经M3、M5、M7 处理后在25℃下进行贮藏，在贮藏过程中，铁皮石斛饮料的菌落总数均符合饮料的食品安全国家标准，但本产品中最主要的功能性成分多糖在贮藏期间含量明显下降，与铁皮石斛饮料中的多糖在180 d 货架期内不存在明显变化[32]的研究结果不一致，这可能与饮料制作方式不同有关，高压灭菌将会导致石斛多糖损失，本试验M3 处理下的石斛多糖也呈现一致的结果。3种灭菌条件下的饮料多糖含量与灭菌前原液相比，均显著下降，M3处理即高压灭菌方式后的多糖含量下降比M5、M7 处理多，说明生物杀菌剂在一定程度上减少了高温高压杀菌造成的营养成分损失量。但在分别贮藏1 周、2 周后，M5、M7处理下的多糖含量骤然下降，与M3处理的含量相当。M5 和M7 处理均使用了抑菌剂，且2 种方法对贮藏期内多糖含量的影响基本一致，为节约成本，M5处理较优。

Landl 等[33]研究认为饮料中的总酚含量变化与酚类物质是否发生氧化、残余多酚氧化酶酶活、果蔬品种等有关。饮料在pH 4～6 范围内可防止多酚类物质的氧化。3种杀菌处理均导致铁皮石斛饮料的总酚含量下降，但贮藏期间均没有出现明显下降，说明杀菌导致饮料中酚类物质发生了氧化从而降解，由于铁皮石斛饮料在pH 5左右，有效阻止了多酚类物质的氧化。在同一贮藏期内，3 种杀菌方式的总酚含量大致呈现M3≈M7＞M5 的趋势，故在多酚含量方面，M3 和M7为较佳选择。

M3和M5处理下的铁皮石斛饮料pH均无明显变化，这与徐路[31]观察到的贮藏期间铁皮石斛原球茎饮料pH降低的情况不同，可能与杀菌方式不同有关。而M7处理下的铁皮石斛饮料在贮藏1周后升至pH 6左右，可能在Nisin和DMDC生物杀菌剂共同作用下，饮料中的蛋白质被降解，释放出碱性基团，导致pH 上升[34]。虽然16 周贮藏期间菌落总数在食品安全标准内，但考虑细菌更易滋生在碱性环境中，故M3、M5杀菌方式优于M7。

与未杀菌原液相比，3 种杀菌方式均使样品的L值、a绝对值和b值减小，本试验测得杀菌后铁皮石斛饮料总酚含量显著下降，说明酚类物质的反应及变化将引起饮料色泽的改变[35]，并且铁皮石斛饮料贮藏时间的色泽变化与总酚含量变化一致，L值有较小的增加趋势，a值和b值基本不变，总体说明饮料色泽稳定性良好。在25℃贮藏条件下，M3和M5的色泽变化趋势更加平稳，故M3、M5杀菌方式较优。

综合考虑贮藏期间多糖含量、总酚含量、pH 以及色泽稳定性，确定M3和M5为铁皮石斛饮料的较优杀菌方式，为此类饮料的开发生产提供一定参考价值。但当该方法应用于实践生产中时，工艺还需要进一步完善，还需要做放大试验。笔者只研究了未添加食品添加剂的铁皮石斛饮料16 周贮藏期内主要营养物质含量、色泽稳定性等变化趋势，而成品在贮藏期内的变化规律以及更长时间的贮藏品质研究，还有待进一步深入探讨。