兰科植物花香成分研究进展

马迪，肖文芳，李佐，张俊卫，陈和明，吕复兵

（1华中农业大学园艺林学学院，武汉 430070；2广东省农业科学院环境园艺研究所/广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室，广州 510640）

0 引言

兰科(Orchidaceae)植物总称兰花，是被子植物最大的科之一，约有800个属28000多个种，除两极和极端干旱的沙漠外，广泛分布于全球热带、亚热带及温带地区，几个世纪以来一直是植物学家们研究的热点[1]。兰科植物在花部特征上呈多样化，包括漫长的花期、丰富的花色、奇特的花形等，其作为观赏植物在国际市场上备受欢迎[2]。花香是兰科植物重要的观赏性状之一，由一系列复杂的亲脂性、高熔点的低分子挥发性有机化合物(volatile organic compounds，VOCs)组成，在吸引昆虫传粉者对其授粉、抵御病原体侵害、与周围环境互作等方面都起着至关重要的作用；此外，花香成分还广泛应用于香水、化妆品、医药甚至调味品等领域[3-4]。

近年来，随着代谢组学等生物技术的发展，已经鉴定出了部分植物的花香成分，同时分离出了负责植物VOCs 生物合成和调控途径的候选酶基因。然而，由于兰花具有较长的生命周期以及复杂而庞大的基因组，人们对兰花花香合成及调控途径所知甚少，与其他植物相比，兰科植物花香成分相关研究仍处于起步阶段[5-6]。目前，关于兰科植物花香成分的研究主要集中在VOCs 的检测及鉴定上，花香成分主要分为萜烯类化合物、苯丙环类/苯丙类化合物、脂肪酸衍生物等3类，其中萜烯类化合物是大部分兰科植物的最主要花香成分。兰科植物的VOCs 复杂多变，导致在对其进行检测时极易受到各种因素影响。至于花香成分的生物合成及相关代谢调控途径等，仅有少部分萜烯类途径被明确报道。笔者综述不同兰科植物花朵香气成分的异同、影响花香成分检测的因素及相关合成调控因子，旨在为兰科植物花香物质的利用、香花品种选育提供参考。

1 兰花花香成分

1.1 兰花花香成分生物合成途径

基于挥发性有机物的结构性质和合成方式，通常将兰花花香成分归为萜类化合物、苯丙烷类/苯环类化合物以及脂肪酸衍生物3类[7-8]。

萜类化合物广泛存在于各种植物中，是植物花香成分中最大的一类，包括单萜、倍半萜、双萜、三萜等各类物质[9-10]。萜类化合物的基本骨架为异戊二烯(C5)，主要通过2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2-methy-Derythrito- 4- phosphate，MEP) 途径和甲羟戊酸(mevalonic acid，MVA)途径2 条途径生成萜戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)，IPP 和DMAPP在一系列酶的作用下完成各种萜类物质的合成及修饰[11-13]（图1）。

图1 兰科植物花香成分的生物合成途径

丙烷类/苯环类化合物为第二大类的植物花香成分，由莽草酸(shikimate，SA)途径中合成的芳香族氨基酸苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)通过各种酶的催化生成苯甲醛/醇、苯乙醛等化合物[14-16]。

脂肪酸衍生物是含量最少的一类，亚油酸和亚麻酸在脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)作用下生成氢过氧化合物中间体，经一系列催化反应生成茉莉酸甲酯和其他脂肪酸衍生物[17-18]。

1.2 常见兰花花香成分

目前，多种兰花的花香成分已被检出（表1）。综合检测结果来看，不同种属间的兰花花香成分存在异同，且挥发物的相对含量也存在差异。袁媛等[21]分析了9 个不同品种的蕙兰花朵挥发性成分，发现所有品种均含有金合欢醇及茉莉酸甲酯，除‘郑孝荷’外，在另外8 个品种中的相对含量均较高，但不同品种中的其他主要成分则不尽相同，‘适圆’、‘大一品’和‘金奥素’中均含有α-愈创木烯，香叶醇则仅在‘适圆’和‘仙绿’中检测到。夏科等[42]对7 种不同的石斛兰鲜花进行了GC-MS 分析，发现各品种中均存在(1R)-(+)-α-蒎烯和顺式-β-罗勒烯，其中顺式-β-罗勒烯在翅梗石斛中含量最高，(1R)-(+)-α-蒎烯在鼓槌石斛中含量最高，而桧烯仅存在于春石斛‘818’中。在鸟喙文心兰、蜜糖文心兰和卡特兰‘大新1 号’中，含量最高的挥发性有机物均为(顺)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯[33,53]，但其他香气成分各不相同，鸟喙文心兰主要为丁羟甲苯和十四烷，蜜糖文心兰主要为α-荜澄茄油烯和(反)-3-己烯-1-醇，卡特兰‘大新1 号’则主要为苯甲醛和甲苯；大花惠兰‘Sunny bell’和荧光蝴蝶兰的花香主要组成成分均为芳樟醇，但在2 个不同种中芳樟醇的相对含量并不相同[25,47]。

表1 部分兰花花朵主要挥发性成分

从花香成分的类型看，萜烯类化合物在兰花花香成分中占有主导地位。倍半萜金合欢醇是蕙兰、春兰中相对含量最高的花香组成成分[21,27]；而文心兰多数品种中花香组成成分含量最高的罗勒烯及其异构体(Z)-3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯也是萜烯类物质[29-33]；蝴蝶兰的主要组成成分为单萜类的芳樟醇和沉香醇[44-49]。但也有部分兰科花卉的花香物质主要成分为苯丙烷类/苯环类化合物或者脂肪酸衍生物。如文心兰‘白仙女’和‘红梦香’的花香主要成分为苯乙醛和苯甲醛[34]，大花惠兰‘大凤’的则为脂肪酸衍生物亚麻酸乙酯和亚油酸甲酯[24]，这2 种物质同时也是鼓槌石斛和大包鞘石斛中含量较大的挥发性化合物[43]，而大花奇唇兰的花朵主要挥发物为己醛和脂肪酸衍生物乙酸十六酯[59]。石斛兰略有不同，主要挥发性有机物组成成分更为丰富，萜烯类、苯丙烷类、脂肪酸衍生物的含量不相上下，不同种中的组成和占比均不相同[36-43]。

花朵中某一种挥发性有机物含量并不能准确反映出它对花朵整体香气的贡献程度，香气强度值为某一组分挥发物的含量与其香气阈值的比，是衡量挥发性物质对香气贡献度的重要指标，挥发物的香气强度值越大，对香气的贡献也就越大，而不同挥发物的香气特征则决定了其嗅感类型[62]。不同兰花的花香由其花朵挥发物中香气强度值高的几种主要致香成分决定，具有香甜气味的茉莉酸甲酯和金合欢醇是蕙兰、建兰‘小桃红’产生浓郁香味的主要物质[21-22]，而蜜糖文心兰和香水文心兰的主要赋香成分是橙花油气味的3,7-二甲基-1,3,6-辛三烯[31,33]，香气阈值较低的水果香味的乙酸辛酯、木香味的α-蒎烯、香甜味的3-蒈烯和花香味的罗勒烯等是多数石斛的主体香气成分[37-40]；花香型的芳樟醇是蝴蝶兰的关键致香成分，也是大多数兰科植物的香气特征物质之一[45-47]。嗅感无香的兰花花朵也存在挥发性成分，嗅感不具花香的蝴蝶兰花朵中挥发性成分主要是反式-壬烯醛和黄瓜醛，但也能检测到微量的致香成分芳樟醇和香叶醇，但其微量挥发未达嗅觉阈值[51]。

2 兰花花香成分检测的影响因素

2.1 采样时期

同一朵花在不同开花时期、同一开花时期一天中的不同时段所释放出来的挥发性有机物的种类和含量均不相同。黄昕蕾等[36]检测发现鼓槌石斛在花蕾期、始花期、盛花期、衰败期检测出的花朵挥发性成分种类分别是3、6、31、5种，不同花期挥发性成分的种类和释放量皆呈先上升后下降的趋势,在盛花期达到最高，而盛花期花朵随一天中开放时段的不同，香气成分种类和释放量也呈先上升后下降的趋势，在14:00 时达到最高。轭瓣兰不同花期香气成分的变化和杂种卡特兰‘3G’不同开花阶段的挥发性有机物变化与鼓槌石斛的一致，都是在盛花期挥发性有机物的相对含量最高，种类最多[52,55]。蝴蝶兰‘Nobby's Pacific Sunset’在完全盛开的第8天9:00—13:00香味浓度最高，9:00时达到峰值，白天的主要香气物质为芳樟醇，而在夜间（19:00—次日03:00）α-法尼烯的挥发量增加，芳樟醇则减少[48]。大叶蝴蝶兰的主要致香物质芳樟醇在4:00—10:00 内释放量开始逐步增加，10:00—16:00达到峰值，然后逐渐减少[45]。

2.2 采样部位

兰花花器官分为花瓣、萼片、唇瓣和合蕊柱，不同种类的兰花花朵不同部位的挥发性有机物释放量和种类并不相同。检测发现杂交兰‘K18’的花瓣释放的挥发性成分种类最多，达21 种，主要成分为β-石竹烯(37.90%)，唇瓣释放的主要成分为β-罗勒(48.26%)，合蕊柱释放的挥发物种类最少，仅13种[26]。黄绿花色的细茎石斛中，同样是花瓣释放的挥发性物质种类最多，达27种[40]。文心兰‘Rosy Sunset’的花瓣和萼片是花朵挥发物释放的主要部位，且芳樟醇是相对含量最高的挥发物，而唇瓣和合蕊柱的主要挥发性成分组成与花瓣和萼片并不相同，以苯甲醛、β-月桂烯和β-石竹烯为主，且释放量较低[35]。颜凤霞等[28]从西藏虎头兰的花瓣、唇瓣和合蕊柱中分别鉴定出72、66和62种化合物，发现花瓣是西藏虎头兰的主要香气释放部位。但蕙兰‘守良梅花’花朵挥发性有机物却主要由合蕊柱释放[63]。

2.3 采样环境

进行花朵挥发物检测时样品所处的环境会影响其挥发物的释放，进而影响检测结果。多种环境因素中，温度和光照是影响兰花挥发性有机物的主要因素。通常种植在阳光充裕、温度稍高处的兰花香味会更浓郁，有学者观测到大叶蝴蝶兰在光照充足的上午香味最浓，到下午香味明显减弱[44]。另外，光质对兰花花朵挥发性物质释放也有一定影响，蓝光、远红光相较于红光更能促进单萜物质的积累[45]。高温同样会促进文心兰花朵挥发物的释放，香水文心兰在30℃时能检测出43种挥发物，其中罗勒烯、α-蒎烯、芳樟醇相对含量均大于20%，而在10℃时仅能检测出24 种物质，仅有罗勒烯相对含量大于1.00%[29]。

2.4 检测技术

在对兰花花朵的挥发性有机物进行提取检测时，最常采用的为固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术。固相微萃取的收集时长和吸附材料等不同，气相色谱和质谱仪器及操作条件的差异都会导致检测出来的挥发性物质成分和含量产生差异。张莹等[29]和陈艺荃等[30]均采用固相微萃取法对香水文心兰的花朵挥发性成分进行检测，但检测时所用的吸附柱材料和质谱仪均不相同，检测出来的主要挥发性物质也不相同。在蝴蝶兰‘Nobby’s Pacific Sunse’花香物质检测中使用了5种不同的固相微萃取吸附柱，包括100 μm PDMS、85 μm 聚丙烯酸酯、65 μm CW/DVB、85 μm CAR/PDMS 和50/30 μm DVB/CAR/PDMS，结果表明吸附涂层为50/30 μm的DVB/CAR/PDMS吸附柱萃取能力最佳[48]。针对篦叶兰不同个体的花朵进行挥发性成分检测时，采用PDMS涂层的萃取柱萃取15 min，检测出的挥发性成分十分单一，主要为2-甲氧基-4-乙烯基苯酚，在大多数个体中的占比均超过99%[57]。

3 兰花花香成分合成及调控相关基因

萜烯类化合物是部分具花香兰花花朵的主要致香成分。针对兰花花香挥发性物质合成与调控相关基因的研究多集中在萜烯类物质代谢途径中（表2），相对而言苯环/苯丙烷类和脂肪酸衍生物代谢途径中相关基因的研究则较少[64,65]。

表2 部分兰花挥发性物质调控因子

萜类合成酶基因(TPS)是萜烯类物质合成途径中的关键基因之一。陈艺荃等[30]在3种文心兰转录组中筛选出了5个TPS基因，其中OnTPS4在3个品种中均高表达，说明OnTPS4在3个品种中对香气的形成均起到重要作用，而OnTPS3仅在‘黄梦香’中表达量较高，而OnTPS1、OnTPS2、OnTPS5则在香水文心中表达量偏高，是调控香水文心兰萜类化合物合成的重要基因。TPS基因家族成员DoTPS10和DoGES1基因在铁皮石斛中分别负责将GPP转化为芳樟醇和香叶醇，在铁皮石斛整个开花阶段均高表达，并且通过外源施加茉莉酸甲酯(methyljasmonate，MeJA)能够明显上调DoTPS10和DoGES1的表达量，从而促进铁皮石斛花香物质成分中芳樟醇和香叶醇的积累，表明DoTPS10和DoGES1是调控铁皮石斛花香主要成分芳樟醇和香叶醇的重要基因[66-67]。Chuang 等[7]对荧光蝴蝶兰的研究发现PbGDPS可能在调控单萜物质（香叶醇和芳樟醇）的生物合成中起关键作用，PbTPS5和PbTPS10的表达量与芳樟醇和香叶醇的产量基本一致。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是萜类物质生物合成MVA途径中的关键酶之一，萼脊兰中SjHMGR基因在盛花期高表达，在蕾期则几乎不表达，且在营养器官低表达，而在花瓣、萼片中高表达，说明其与萼脊兰花香物质合成可能密切相关[68]。

MYB类转录因子在花香化合物苯丙素类/苯丙环类化合物、脂肪酸类衍生物合成中起着重要作用[69]。兰属‘Sael Bit’盛花期花朵的主要挥发性成分为2-甲基丁醛、2-甲基戊醛和Z-2-辛烯醛等苯环类化合物，CsMYB1可以调节苯丙素类/苯类化合物的合成，且CsMYB1在其整个开花阶段均有表达，其中盛花期表达量最高，且其在花瓣和合蕊柱中的表达量高于萼片[23]。茉莉酸甲酯是蕙兰的主要致香成分之一，Xu等[70]对其4 个CfMYB基因进行了克隆并转化烟草，发现转基因烟草茉莉酸甲酯合成途径中的CfAOC（丙二烯氧化物环化酶基因）和CfJMT（羧甲基转移酶基因）的启动子被激活，茉莉酸甲酯的积累增多，表明CfMYB能够调控茉莉酸甲酯的合成。

4 问题及展望

随着生物技术的不断进步，花卉定向育种取得了显著成果，花香作为观赏花卉最重要的观赏性状之一，也越来越受到重视。花香除具有吸引昆虫授粉、抵御病原体和防止有害生物侵害等作用，还广泛应用于香水、化妆品、医药等领域，具有极高的价值。“兰为王者香”，作为中国传统名花，国兰泛指兰属花卉，具备浓郁的芳香，而颜色艳丽、商品化程度极高的热带兰却基本不具芳香或香味极淡。但不论是对浓郁芬芳的兰属，还是对色彩艳丽的蝴蝶兰属等兰科植物的花香相关研究均处于起步阶段，远远落后于玫瑰、茉莉等物种。因此对兰科植物花香成分的研究还有待深入。

目前，关于兰科植物花香成分的研究主要还存在一些问题：（1）关于兰花花香成分的研究主要集中在单个品种或同属品种的成分检测鉴定上，缺乏快捷高效的技术分离兰花花中各种花香成分。（2）对于兰科植物花香相关物质的完整合成途径和转录调控均不太清楚，且三大合成途径中只有萜烯类化合物的合成途径相关基因有少量研究。（3）调控花香化合物代谢的关键基因及调控机制的研究缺乏，导致分子标记辅助育种、转基因研究及定向改良十分困难，严重限制了兰科植物的进一步高效利用。

针对以上问题，笔者认为有关兰科植物花香性状的未来研究方向可以围绕以下方面进行：（1）可同时对某种或多种香型和无香型兰花的父母本、姊妹株系花香成分等进行分析鉴定，探究其遗传规律和分离规律等，为香花兰花的选育提供一定的依据。（2）可参考其他植物相关萜烯类、苯丙类/苯丙环类、脂肪酸类化合物的生物合成途径、转录因子及分子调控机制，或基于目前已完成测序的兰科植物基因组数据库，深入筛选挖掘花香相关基因，完善兰科植物相关花香化合物的合成代谢途径，为香花育种提供完整的理论支持。（3）可利用瞬时转染和稳定转染等载体介导技术将香花基因转入无香兰花品种，从而达到无香优良品种定向改良为香花品种，有香品种定向改良有效或高价值成分含量进一步提高，这将是今后的研究重点和目标。