液质联用检测含乳果冻、布丁三聚氰胺的研究

刘超，吕雪梅，景赞

乐山市食品药品检验检测中心（乐山 614000）

三聚氰胺分子式为C3H6N6，三聚氰胺又称为密胺、蛋白精，在工业上常被用作化工原料，也可以添加到涂料、粘合剂等行业中[1-2]。三聚氰胺在生产生活中并不能作为食品原料或是添加剂加入到食品生产中，但在长期的食品储存中，三聚氰胺可能会从环境或者包装材料进入食品中[3]。在三鹿奶粉事件发生后，我国对于三聚氰胺在食品中的含量要求：婴幼儿食品，其限量为1 mg/kg；其他食品，其限量值为2.5 mg/kg。高于限量值的食品在长期食用中会对身体造成严重影响[4-5]。因此，检测结果的准确性非常重要。

在日常检测中不可避免遇到所测样品含有胶基。因胶基的性质，在提取操作前应对胶基进行溶解[6-7]。试验探究如何溶解胶基以利于试验的开展。

液质联用技术利用液相色谱的高分离度和质谱的良好选择性和灵敏度[8-10]，是现代实验室不可或缺的仪器。在液质联用检测过程中，基质中存在一些非挥发性的组分与待测物质在离子化过程中产生相互竞争，这种竞争会影响电喷雾接口处的离子化效率，这种现象称为基质效应，基质效应在测定数据时会带来影响[11-13]。试验探究消除基质效应的方法，以提高检测数据的准确性。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Agilent-API4500液质联用仪（美国AB SCIEX公司）；ME104E电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；HT190R高速台式冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；LSPE-12固相萃取仪（福建叶翎仪器有限公司）；KQC 7008超声波清洗机（杭州旌德仪有限公司）；HSC-12A氮吹仪（北京佳航博创科技有限公司）；HSKC-B氮吹仪（锦江欢仪器有限公司）；SHNA-BUC水浴恒温振荡器（安顺冠德精仪器有限公司）；XAH-D旋涡混合器（普安前旗裕仪器有限公司）；HH-6数显恒温水浴锅（石家庄英特科技仪有限公司）。

1.2 材料与试剂

三聚氰胺标准品（99.0%，生产批号：G133044，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；三聚氰胺内标标准品（Melamine-13 C3，100 μg/mL，CAS 1173022-88-2）；甲醇、乙腈（均为色谱纯）；三氯乙酸（分析纯）。

果冻、布丁（市售）。

1.3 试验条件

色谱柱为CAPCELL PAK CR（1︰4，150 mm×2.0 mm，5 μm）；流动相为乙酸铵溶液-乙腈体积比1︰1，乙酸调至pH 3；进样体积10 μL；柱温40 ℃；流速0.3 mL/min；扫描方式ESI+；离子喷雾电压4 500 V；气帘气压力30 psi；雾化气压力30 psi；辅助气压力30 psi；离子化温度450 ℃。三聚氰胺及其内标质谱参数见表1。

表1 三聚氰胺及其内标质谱参数

1.4 试验方法

样品经“2.1”溶解后，参照GB/T 22388—2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》[14]第二法 液相色谱-质谱/质谱法（LC-MS/MS）中“4.4.1.1”方法进行提取、“4.4.2”方法进行净化。

1.5 标准溶液的配制

三聚氰胺标准储备液：准确称取10 mg三聚氰胺标准品至10 mL容量瓶中，甲醇-水（1+1，V/V）定容至刻度，配制成1 mg/mL的三聚氰胺储备液。

三聚氰胺内标储备液：准确吸取1 mL三聚氰胺内标溶液至10 mL容量瓶中，甲醇-水（1+1，V/V）定容至刻度，配制成10 μg/mL的三聚氰胺内标储备液。

三聚氰胺标准中间液：准确吸取0.025 mL三聚氰胺标准储备液至25 mL容量瓶中，甲醇-水（1+1，V/V）定容至刻度，配制成1 μg/mL的三聚氰胺标准中间液。

三聚氰胺内标中间液：准确吸取1 mL三聚氰胺内标储备液至10 mL容量瓶中，甲醇-水（1+1，V/V）定容至刻度，配制成1 μg/mL的三聚氰胺内标中间液。

2 结果与分析

2.1 胶基的溶解

检测样品为含乳型果冻和布丁，由于果冻和布丁样品中均含有胶基，提取前需将样品中的胶基进行溶解，进行三聚氰胺的提取。在对果冻、布丁样品中胶基的溶解探究过程中，尝试3种试验方法，分别称3份取1 g果冻样品和3份1 g布丁样品，置于50 mL塑料离心管中，分别用3种溶液作溶剂（方法一，3 mL纯水；方法二，2 mL纯水+2 mL 95%乙醇；方法三，3 mL 60%乙醇）。在恒温水浴锅中加热10 min，观察样品的溶解情况，结果见表2

表2 布丁、果冻溶解情况

由表2可以看出，对比其他2种溶解试剂溶解效果，溶解试剂为纯水时溶解效果最好，原因可能是果冻、布丁样品中均含有明胶，明胶是一种大分子物质并且易与水结合，虽然3种溶解试剂中均含有水，但明胶不溶于乙醇；甲醇易被氧化生成甲醛，明胶遇到甲醛时，明胶成为不可逆的凝状胶体，且不溶于水，故3种溶解试剂中纯水溶解效果较好。

2.2 基质效应的评价

采用提取后添加标准物质法进行评价，基质效应ME=B/A（B表示基质溶液中分析物的峰面积，A表示纯溶剂中分析物的峰面积）。B/A＞1，表示基质对分析物的响应具有增强作用；B/A＜1，表示基质对分析物的响应具有降低作用；B/A=1，表示溶液体系中不存在基质效应。区间范围内基质效应的评价如下：B/A介于0.8~1.2，基质效应干扰程度低，可不用消除基质效应；B/A＜0.8或B/A＞1.2，基质效应干扰强烈，需要消除或降低基质效应对检测结果的影响。

由表3可以看出，布丁、果冻试样中基质效应均＜0.8，表明基质对分析物的响应具有降低作用，且因ME显著小于0.8，表明基质效应干扰强烈，需要消除或降低基质效应对检测结果的影响。

表3 基质效应的评价

2.3 外标法对基质效应的消除

2.3.1 随行加标

取6个空白样品至6个50 mL离心管中，分别加入5，10，20，40，80和100 μL三聚氰胺标准中间液，按照“1.4”进行样品处理。配制成质量浓度为5，10，20，40，80和100 ng/mL的标点。另取9个空白样品，分别配成浓度为10，25和50 μg/kg的低、中、高3组水平，做三水平三平行加标回收试验。

2.3.2 基质配标

取6个空白样品至6个50 mL离心管中，按照“1.4”进行样品处理，制备成空白溶液。分别取5，10，20，40，80和100 μL三聚氰胺标准中间液，用空白溶液配制成5，10，20，40，80和100 ng/mL的标点。另取9个空白样品，分别设置成10，25和50 μg/kg的低、中、高3组水平，做三水平三平行加标回收试验。

由表4可以看出，用外标法（随行加标、基质配标）对样品进行加标回收率测定，相对标准偏差（SRSD）值小于5%，符合要求。但是加标回收率均较低（低于90%），回收效果不好，说明外标法不能彻底消除基质效应对结果的影响。

表4 外标法加标回收率、精密度（n=3）

2.4 内标法对基质效应的消除

取6个10 mL容量瓶，分别加入5，10，20，40，80和100 μL三聚氰胺标准中间液，每个容量瓶中加入20 μL三聚氰胺内标中间液，配制成三聚氰胺质量浓度为5，10，20，40，80和100 ng/mL的标点，每份溶液中内标浓度为20 ng/mL。以三聚氰胺浓度为横坐标，三聚氰胺与内标物峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线。另取9个空白样品，分别设置10，25和50 μg/kg的低、中、高3组水平，做三水平三平行加标回收试验。

由表5和表6可以看出，内标法对果冻、布丁进行加标回收测定，平均加标回收率在98%~105%，方法准确度好，表明内标法能彻底消除因基质效应对结果的影响。相对标准偏差（SRSD）值小于0.970 9%，符合试验精密度要求、精密度可靠。

表5 果冻中三聚氰胺加标回收率测定结果（n=3）

表6 布丁中三聚氰胺加标回收率测定结果（n=3）

2.5 方法学验证

2.5.1 三聚氰胺及其内标质谱图

图1 三聚氰胺及其内标一级质谱图

图2 三聚氰胺内标二级质谱图

图3 三聚氰胺二级质谱图

2.5.2 标准曲线方程和线性范围

取6个10 mL容量瓶，分别加入5，10，20，40，80和100 μL三聚氰胺标准中间液，每个容量瓶中加入20 μL三聚氰胺内标中间液，配制成三聚氰胺浓度为5，10，20，40，80和100 ng/mL的标点，每份溶液中内标浓度为20 ng/mL。以三聚氰胺浓度为横坐标，三聚氰胺与内标物峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表7。

表7 三聚氰胺标准曲线

2.5.3 加标回收率、精密度试验

取9个空白样品，分别设置低、中、高3组水平，每个水平设置3组平行，低、中、高浓度分别为10，25和50 μg/kg，低、中、高3组水平平行测定3次。以测定结果与理论加标量的比值表示加标回收率，以3次测定结果的SRSD表示精密度，结果见表8和表9。

表8 布丁三聚氰胺加标回收率、精密度（n=3）

表9 果冻三聚氰胺加标回收率、精密度（n=3）

由表8和表9可以看出，内标法对布丁、果冻进行精密度的测定时，相对标准偏差（SRSD）值小于5%，表明精密度可靠。平均加标回收率在103%~106%，加标回收率高，方法准确。

3 结论

液质联用检测含乳型果冻、布丁中三聚氰胺含量，试验优化样品中胶基溶解的方法。比较外标法和内标法降低液质联用仪在检测中带来的基质效应影响，取得理想的试验效果。方法学验证表明，内标法进行检测时对样品中三聚氰胺平均加标回收率高，精密度可靠，并且利用这种方法对基质效应的消除效果明显。