五布红柚类胡萝卜素物质的提取鉴定及焦甜香效果研究

邱光明，周远祥，朱丛戎，周胜

重庆中烟工业有限责任公司（重庆 400060）

五布红柚（Citrus grandisOsbeck cv.Wubuhongyou）又称五布红心柚，原产重庆巴县五布乡。为选出的地方良种柚，以重庆市栽培为多，广西、浙江等地也有引种。红柚中含有丰富的类胡萝卜素。研究发现，成熟时期的五布红柚果实中含有丰富的类胡萝卜素，红柚中以番茄红素为主要呈色色素，不同类型蜜柚类胡萝卜素的含量存在明显差异[1-2]。越来越多证据表明，红柚中含有丰富的类胡萝卜素类化合物，具有多种有益效果[3-5]。流行病学证据表明，摄入高含量类胡萝卜素类和低含量脂肪酸的食物（如水果和蔬菜）与降低人类疾病如心血管疾病、糖尿病和癌症等风险直接相关[2, 6-7]。

五布红柚提取物中的类胡萝卜素是亲脂性的。其结构不同，提取方法各异[8-9]。采用混合提取溶剂，能够大幅提高提取效率，从而能够准确进行分析和定量。类胡萝卜素的检测方法主要为高效液相色谱法，该方法具有分离效能高、分析速度快、样品用量少等优点，是应用最广也最适用于类胡萝卜素物质的分离测定方法[9-11]。

采用灵敏度更高的VWD紫外检测器的高效液相色谱仪，结合梯度洗脱建立五布红柚提取物中5种类胡萝卜素物质的测定方法，并对其精确度、回收率等进行评价；比较不同来源五布红柚提取物对其5种类胡萝卜素物质含量及加香效果的影响，以期为五布红柚提取物果实品质评价和在香精香料中的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Agilent 1260 HPLC系统，配有输液泵、自动进样器、柱温箱、在线脱气装置及化学工作站；离心机（科大创新股份有限公司）；200 g 摇摆式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海一恒公司）；0.45 μm及0.22 μm针头微孔滤膜过滤器（均购于美国TEDIA公司）；Biocel型密理博超纯水系统（美国密理博公司）。

类胡萝卜素物质标准品：番茄红素（纯度≥99.0%）、β-胡萝卜素（纯度≥99.0%）、玉米黄素（纯度≥99.0%）、α-胡萝卜素（纯度≥99.0%）、花药黄素（纯度≥99.0%），均购于Sigma公司，保存在4 ℃黑暗中。

HPLC级甲醇、乙腈和正己烷，丁基化羟基甲苯（BHT，≥99% FG），丙酮（GR级），购自上海Macklin生化有限公司。HPLC级去离子水来自Milli-Q 50系统（西班牙Millipore Iberica S.A.）。将类胡萝卜素物质标准储备溶液溶解在二氯甲烷中，用甲醇稀释至0.1 mg/mL，并在-80 ℃下储存。0.1，0.5，1.0，10.0，100.0，200.0，500.0和1 000.0 mg/L的类胡萝卜素物质标准品用于生成测试样品定量的回归方程。

1.2 五布红柚提取物样品处理

将收获的五布红柚在37 ℃下保存72 h，通过AACC 14-50方法测定样品水分，研磨成细粉。在提取类胡萝卜素之前，将面粉储存在18 ℃弱光下，以使降解最小化。

从五布红柚中提取出类胡萝卜素。将1.0 g五布红柚添加到聚丙烯或硼硅酸盐管中的6 mL提取溶液（丙酮与甲醇7︰3，V/V，0.1% BHTW/V）中，并在涡流混合器中剧烈混合45 s。将混合物在35 ℃、恒温振荡器上、弱光下以80 r/min摇动1 h。将提取物在10 000 r/min（4 ℃）下离心10 min。将固体提取残余物加入到6 mL提取溶液中，摇动并离心。将合并的上清液在氮气流蒸发器中于35 ℃蒸发至干。

将干燥残余物在3 mL乙醚和3 mL水解介质（50%KOH水溶液和乙醇1∶9，V/V）中重构，并在室温下黑暗中振荡2 h。将3 mL水解产物转移到另一个试管中，并加入3 mL乙醚/正己烷（1∶1，V/V）和3 mL水。将试管在4 ℃下以10 000 r/min离心10 min，用针和注射器除去含有KOH的下层（水相）。有机层在氮气流蒸发器中于35 ℃蒸发至干燥。

将干残留物加入0.5 mL乙腈/甲醇/正己烷（7︰2︰1，V/V），转移到1.5 mL试管中，并在10 000 r/min（4℃）下离心5 min。上清液通过0.22 μm过滤器过滤，并储存在-20 ℃棕色微量离心管中，直至HPLC分析。对于HPLC分析过程中的自动取样，将50 μL样品转移到带螺旋盖的琥珀色玻璃瓶中。

1.3 色谱条件及方法评价

使用Infinity Lab Poroshell 120EC-C18柱（4.6 mm×150 mm，4 μm），在Agilent 1260 HPLC系统上进行色谱分析。使用自动进样器自动进样50 μm的注射体积和1 mL/min的流速。柱烘箱的温度分别保持25 ℃。叶黄素在450 nm处被检测到。流动相为乙腈（A相）、甲醇（B相）和正己烷（C相）。流动相通过超声处理20 min脱气。梯度洗脱程序：76%溶液A、21.5%溶液B、2.5%溶液C的初始条件。流动相A的比例在20~22 min内从76%线性下降至70%，B在20~22 min内从21.5%线性下降至20%。在28~30 min内，A相增加到76%，B相增加到21.5%。

5种类胡萝卜素标准品的5种不同稀释度用于设置分析条件和确定保留时间。五布红柚样品中的类胡萝卜素通过保留时间进行鉴定，并使用外标法生成的五点校准曲线回归线进行定量。给出校准线的线性。通过添加类胡萝卜素标准品来评估准确度，评估类胡萝卜素添加浓度的回收率。

1.4 加香分析试验

分别将1.2小节所得提取液，用丙二醇稀释到50%质量浓度，混合均匀后，按0.05%的用量，用微量喷雾器分别均匀地喷于成品烟丝50 g上，放入温度22±1℃、相对湿度60%±2%的恒湿箱内平衡24 h，卷制成烟支，由评吸专家小组进行评吸。空白组只加入等量蒸馏水。

2 结果与讨论

2.1 色谱分析结果及评价

基于该方法的色谱条件结合VWD检测器，对5种类胡萝卜素物质标样进行最大吸收光谱扫描，扫描波长190~500 nm。分析不同类胡萝卜素物质的最大吸收光谱，5种类胡萝卜素物质在450 nm左右均有较大吸收峰，因此，选取450 nm作为类胡萝卜素物质的定量检测波长。按照方法提供的液相色谱分离和分析条件，分别精密吸取标准品溶液、重庆巴县产五布红柚提取物、广西宾阳县产五布红柚提取物、浙江丽水产五布红柚提取物、湖南怀化产五布红柚提取物供试样品溶液各50 μL，自动进样器进样，分析结果如图1所示。结果表明，在上述色谱条件下，色谱峰尖锐，各相邻色谱峰之间的分离度均大于1.4，理论塔板数均大于3 000，满足类胡萝卜素物质定量要求。

2.2 色谱分析检测方法学考察

2.2.1 色谱分析方法线性范围及检出限

精密吸取混合标准品溶液，分别稀释0，5，10，20，50和100倍，吸取上述6种浓度的标准品各10.0 μL进行测定。以各色谱峰峰面积积分值（Y）对其浓度（X）进行线性回归。结果显示，5种成分至少在0.02~500 mg/L的线性范围内线性关系良好（r＞0.990 0），检出限（rSN=3）在0.003~0.03 mg/kg，回归方程、相关系数见表1。

表1 类胡萝卜素物质的线性关系（n=6）

2.2.2 色谱分析方法验证

吸取50.0 μL标准品，连续进样6次，分别记录5种组分的峰面积，计算得番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄素、α-胡萝卜素、花药黄素的SRSD（n=6），分别为1.36%，2.46%，3.37%，2.52%和1.77%，表明仪器精密度良好。

取红柚提取物供试样品溶液，在0~24 h内每隔4 h进样1次，分别记录5种组分的峰面积，计算得番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄素、α-胡萝卜素、花药黄素的SRSD（n=6），分别为3.79%，2.39%，2.49%，3.66%和2.75%，表明供试样品溶液中5种组分在24 h内稳定。

称取6份红柚提取物样品，制备供试样品溶液，在高效液相色谱下测得番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄素、α-胡萝卜素、花药黄素的SRSD（n=6），分别为4.25%，3.99%，2.74%，3.95%和2.72%，表明该方法重现性良好。

取6份红柚提取物（番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄素、α-胡萝卜素、花药黄素含量分别是316.79，50.81，7.19，6.37和4.03 mg/kg，总计类胡萝卜素物质含量为221.42 mg/kg），每份2.00 g，精密称定，置于50.0 mL具塞锥形瓶中，分别精密加入3个不同浓度的番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄素、α-胡萝卜素、花药黄素标准品（10.0，40.0和80.0 mg/kg），按照前述制备供试样品溶液，在高效液相色谱下色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。结果显示，番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄素、α-胡萝卜素、花药黄素的平均回收率（n=6）在86.39%~105.96%之间，SRSD（n=6）在2.65%~4.30%。

表2 类胡萝卜素物质检测加标回收率

2.3 不同产地红柚样品检测结果

分别取上述五布红柚提取物样品，制备供试样品溶液，在高效液相色谱下进样测定，计算5种组分的含量，结果见表3。

表3 不同样品类胡萝卜素物质测定结果单位：mg/kg（以干基计）

从表3可以看出，不同五布红柚提取物中番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄素、α-胡萝卜素、花药黄素总含量由高到低为五布红柚（重庆巴县）＞五布红柚（广西宾阳县）＞五布红柚（浙江丽水）＞五布红柚（湖南怀化）。

2.4 烟丝加香效果

不同来源五布红柚提取物在烟草中的加香试验评吸结果见表4。重庆巴县五布红柚提取物能与烟香协调，增加香气厚实、饱满度和爆发力，改善余味，而且能增加焦甜香韵，明显提升丰满度和烟气透发明亮度。

表4 烟丝加香效果评价结果

3 结论

采用高效液相色谱法同时测定五布红柚提取物及不同来源得到的五布红柚提取物中番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄素、α-胡萝卜素、花药黄素5种类胡萝卜素物质含量，初步比较不同提取方法对5种类胡萝卜素物质含量的影响。检测方法显示，5种成分至少在0.02~500 mg/L的线性范围内线性关系良好（r＞0.990 0），检出限（rSN=3）在0.003~0.03 mg/kg，加标回收率在86.39%~105.96%，检测方法灵敏有效。重庆巴县产五布红柚提取物的烟丝加香最为明显，尤其在增加焦甜香韵方面较为明显，这与对类胡萝卜素物质中含量的试验结果一致。