基于谱效关联分析的广枣在三味檀香散中的作用研究△

梁方圆，布仁，杨利，陆景坤，廖园红，王跃武*

1.内蒙古医科大学 药学院，内蒙古 呼和浩特 010010；2.内蒙古库伦蒙药有限公司，内蒙古 通辽 028000；3.内蒙古医科大学 基础医学院，内蒙古 呼和浩特 010010

三味檀香散原方载于《四部医典》，是蒙古族、藏族医治疗心热病的常用方，由广枣Choerospondiatis Fructus、肉豆蔻Myristicae Semen 和檀香Santali Albi Lignum 3 味药组成，其中广枣为方中君药[1]。三味檀香散具有清热、祛风、养心之功效，临床用于治疗冠心病、心绞痛、心力衰竭等缺血性心脏病[2]。本课题组前期研究表明，三味檀香散能通过调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）和FoxO 信号通路显著降低模型大鼠心肌缺血-再灌注损伤，但是3种药味的配伍作用及药效物质基础尚不明确[3-4]。

三味檀香散中君药广枣是蒙古族医治疗心血管疾病的特色药材，为漆树科植物南酸枣Choerospondias axillaris（Roxb.）B.L.Burtt &A.W.Hill的干燥成熟果实。广枣中的黄酮、有机酸、酚酸能够减轻心肌缺血再灌注损伤[5]。本课题组前期运用Q-Exactive 高分辨质谱结合指纹图谱法评价了10 批广枣药材质量，以鞣花酸为参照物建立了指纹图谱，并对其共有峰进行化学成分归属，鉴定出广枣中的37 个化合物，发现主要为酚酸类和有机酸类成分[6]。

为了探讨广枣在三味檀香散配伍中的作用，本研究采用高效液相色谱串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱法（HPLC-Q-Exactive-MS/MS）对三味檀香散和广枣的化学成分进行了归属鉴定；观察广枣和三味檀香散对斑马鱼血栓模型、小鼠巨噬细胞RAW246.7 炎症模型和大鼠心肌细胞H9c2 氧化损伤模型的干预作用；采用灰色关联度分析探究广枣在三味檀香散中配伍的药效物质基础。

1 材料

1.1 仪器

Ultimate 3000 型高效液相色谱串联四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；TB-214 型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；SB25-12DTD 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技有限公司）；离心浓缩装置（UT200 型冷阱、CVE-3110 型离心浓缩仪，日本东京理化器械株式会社）；DFC450C 型智能光学正置显微镜（德国Leica公司）。

1.2 试药

一氧化氮（NO）检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；细胞增殖及毒性检测CCK-8 试剂盒（大连美仑生物技术有限公司）；脂多糖（LPS，北京索莱宝科技有限公司）；苯肼（北京百灵威科技有限公司）；邻联茴香胺（阿法埃莎天津化学有限公司）；对照品鞣花酸（批号：11959-201903）、没食子酸（批号：110831-201906）、槲皮素（批号：100081-201610）、柠檬酸（批号：110831-201906）、肉豆蔻醚（批号：190180-201701）、macelignan（批号：111844-201603）、去氢二异丁香酚（批号：111838-201403）、甲基丁香酚（批号：111642-200301）、丁香酚（批号：110725-201917）均购自中国食品药品检定研究院；对照品儿茶素（批号：DETDE000101，乐美天医药德斯特生物公司）；对照品榄香素（批号：487-11-6，北京英莱克发展有限公司）；对照品3,3ʹ-O-二甲基鞣花酸（批号：DE002001）、奎宁酸（批号：QMC-102733）、黄樟素（批号：SFL-966522）均购自北京北方伟业计量技术研究院；所有对照品纯度均≥98%；甲醇、乙腈、甲酸为质谱纯（美国Fisher Chemical 公司）；其他试剂均为国产分析纯。

三味檀香散分别为内蒙古蒙药股份有限公司（批号分别为1908006、1912052、2003059、200014、2101061）、内蒙古库伦蒙药有限公司（批号分别为181235021、200621040、201049076、201049029）、国际蒙医医院（批号：20210505）、内蒙古凯蒙药业有限公司（批号：20051401.1586、20051401.1639、20051401.1683、19121701.0853、19121701.0853、19121701.0833、19121701.0804）生产；广枣药材（批号：302843）购于内蒙古北域药业有限责任公司，经内蒙古医科大学药学院薛培凤教授鉴定为漆树科植物南酸枣Choerospondias axillaris（Roxb.）B.L.Burtt &A.W.Hill 的干燥成熟果实；邻联茴香胺染色液由0.6 mg·mL-1邻联茴香胺、0.01 mol·L-1醋酸钠、0.65% H2O2、40%乙醇配制而成。

1.3 实验动物与细胞

无特定病原体（SPF）级健康SD 大鼠12只，雌雄各半，体质量（230±20）g，由斯贝福北京生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（京）-2019-0010。经内蒙古医科大学医学伦理委员会审核，符合伦理原则（审批号：YKD2018056）。斑马鱼（AB/TU 品系）体长（3.0±0.3）cm，由上海斑马鱼科研服务中心提供。小鼠单核巨噬细胞RAW264.7、大鼠心肌细胞H9c2 均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

2 方法

2.1 HPLC-Q-Exactive-MS/MS定性分析三味檀香散和广枣的化学成分

2.1.1 样品溶液的制备 取4 个不同厂家生产的三味檀香散按照临床等效剂量等比混合，精密称定三味檀香散混合物0.627 g、广枣细粉（过100 目筛）0.209 g 分别置于15 mL 离心管，加入甲醇10 mL，涡旋混匀，超声30 min（频率为40 kHz），离心10 min（4 ℃，1 612.8×g），37 ℃减压干燥，加入甲醇100 μL复溶，即得。

2.1.2 对照品溶液的制备 分别称取对照品适量，加甲醇配成适当质量浓度的对照品储备液，分析前分别取适量配成混合对照品溶液。

2.1.3 色谱条件 ACEEXCEL3 C18-PFP 色谱柱（100 mm×3 mm，3 μm）；流动相为0.2%甲酸甲醇溶液（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～0.8 min，2%～5%A；0.8～1.7 min，5%～10%A；1.7～2.5 min，10%～18%A；2.5～3.3 min，18%～23%A；3.3～4.2 min，23%～28%A；4.2～5.8 min，28%～33%A；5.8～9.2 min，33%～43%A；9.2～11.2 min，43%～46%A；11.2～14.3 min，46%～60%A；14.3～16.0 min，60%～65%A；16.0～17.7 min，65%～68%A；17.7～19.2 min，68%～75%A；19.2～20.0 min，75%～80%A；20.0～20.8 min，80%～2%A；20.8～24.0 min，2%A）；流速为0.3 mL·min-1；4 ℃自动进样，柱温为35 ℃。

2.1.4 质谱条件 采用电喷雾离子源（ESI），MSdd-MS2扫描模式，正、负离子2 种模式下获取质谱信息。负离子质谱条件：鞘气流速为35 L·min-1；辅助气流速为10 L·min-1；喷雾电压为2.8 kV；毛细管离子传输管温度为350 ℃；S-lens电压为50 kV；加热温度为150 ℃；质谱扫描范围为m/z100～1000。正离子质谱条件：喷雾电压为3.5 kV，其余条件同负离子模式。

2.1.5 HPLC-Q-Exactive-MS/MS 定性分析 按2.1.3、2.1.4 项下条件对各样本进行分析，结果导入到Compound Discoverer 3.0 软件，选择软件内置Workflow“Impuroties w Stats Expected w FISh and Unknown Compound Class Scoring and Searches”，在“Search MassLists”中选择自建的三味檀香散化学成分数据库[3]，依据软件分析获得的MassLists、mzCloud结果（mzCloud Best Sim.Match>85）。

2.2 三味檀香散和广枣的药效学研究

2.2.1 含药血清的制备 SD 大鼠随机分为对照组、三味檀香散组和广枣组，每组4 只，雌、雄各半。其中三味檀香散组将不同厂家和批号的三味檀香散混合均匀后，用0.05%羧甲基纤维素钠配制，剂量为8.1 g·kg-1（为临床等效剂量的10 倍）；广枣组将广枣细粉（过100 目筛）用0.05%羧甲基纤维素钠配制，给药剂量为2.25 g·kg-1（为临床等效剂量的10 倍）。各组大鼠连续7 d 灌胃给予相应药物，对照组大鼠给予等量0.05%羧甲基纤维素钠，末次给药1 h后用戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，收集血清分装，-80 ℃备用。

2.2.2 受试物对LPS 诱导的RAW246.7 细胞NO 分泌的影响 将RAW246.7 细胞接种到96 孔板，接种密度为5×104个/孔，每孔100 μL，用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM 高糖培养基培养24 h 后，分为对照组、模型组（LPS 5000 ng·mL-1）、三味檀香散和广枣含药血清干预组，每100 μL 培养体系加入含药血清10 μL，空白组与模型组加入正常动物血清后，模型组和各含药血清组加入LPS，使终质量浓度为5000 ng·mL-1。继续培养24 h后取上清液，用NO 试剂盒分析各组细胞上清液中NO 含量，考察三味檀香散和广枣对RAW246.7 细胞分泌NO 的抑制作用。每组6个复孔，实验重复3次。

2.2.3 受试物对H2O2诱导的H9c2 细胞氧化损伤的影响 取生长状态良好的培养于10% FBS DMEM 的H9c2 细胞，以1×105个/孔密度接种于96 孔板，每孔100 μL，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，分为空白组、对照组、模型组（H9c2 900 µmol·mL-1）、三味檀香散和广枣含药血清组，含药血清加入比例同2.2.2 项下。培养24 h 后，按CCK-8 试剂盒说明书处理，采用酶标仪在490 nm 检测H9c2 细胞活力。每组5 个复孔，实验重复3 次，按照公式（1）计算细胞活力。

2.2.4 受试物对苯肼诱导的斑马鱼血栓模型的影响 常规触发斑马鱼产卵，2～4 h后吸取胚胎并置于表面皿中在孵化箱中孵化，每天换营养液2 次，移除死胎，72 h 后将其移入培养皿中。发育至5 d 时，在解剖显微镜挑选发育正常的斑马鱼胚胎，移入12孔板中，随机分为4 组，即对照组、模型组（苯肼8 µmol·L-1）、广枣含药血清组（225 μg·mL-1）、三味檀香散含药血清组（800 μg·mL-1），每组3 孔，每孔10 条。药物干预16 h 后，用邻联茴香胺染液对斑马鱼染色10 min 后，每组随机挑选10 尾斑马鱼用二甲基亚砜（DMSO）快速清洗，在体视显微镜（60×）观察心脏红细胞染色情况、尾静脉血栓并拍照记录；用ImagePro Plus 6.0 图像处理软件对心脏红细胞染色强度进行定量分析，分别按照公式（2）、公式（3）计算心脏红细胞染色强度、血栓形成率和抗血栓药效。

2.3 谱-效灰色关联度分析

基于药效有效性结果，以RAW246.7 细胞释放NO 抑制率和H9c2 细胞活性为2 组参考序列，以三味檀香散、广枣色谱图峰面积Xi(k) 为比较序列，将变换后的药效数据记为Y(k)，按照公式（4）计算绝对差序列[Δi(k)]，按照公式（5）计算关联系数 [ξi(k)]，按照公式（6）计算关联度（r）。

式中，对于参考数列Y(k) 有若干个比较数列Xi(k)，Δ(min)和Δ(max)分别为所有比较序列绝对差中的最小值与最大值；Δi(k)表示比较数列与参考序列的绝对差；ρ为分辨系数，取0.5[7-8]；n表示比较序列的数据个数。

3 结果

3.1 三味檀香散和广枣成分鉴定及归属

负离子模式下广枣和正、负离子模式下三味檀香散样品UPLC-ESI-MS/MS 总离子流图见图1。Xcalibur 软件提取二级质谱裂解碎片离子信息，结合三味檀香散自建数据库、MassBank 公共数据库，通过对照品及文献比对[6]，共分析和鉴定出三味檀香散中48 个成分，包括18 个木脂素、3 个苯丙素、5个黄酮、8个有机酸、7个酚酸、6个倍半萜、1个氨基酸。共分析鉴定广枣中22个成分，包括8个酚酸、8 个有机酸、6 个黄酮。广枣与三味檀香散的共有成分有20 个，包括3,3ʹ-二氧甲基鞣花酸、3,8-二-O-甲基鞣花酸-2-O-葡萄糖苷、鞣花酸、没食子酸、柠檬酸、苹果酸、儿茶素、柠檬酸单甘酯、柚皮素、槲皮素-3-鼠李糖苷、槲皮素、奎宁酸、3-羟基-3-甲基戊二酸、柠檬酸甲酯、水杨酸、柠檬酸三乙酯、6-羟基吲哚乳酸、甲基鞣花酸葡萄糖苷、诃子酸、原儿茶酸。其中12 个化合物为对照品比对确定。所鉴定的化合物分子式、保留时间（tR）、质谱数据和来源归属见表1。

表1 三味檀香散化学成分鉴定及归属

图1 三味檀香散和广枣总离子流图

广枣成分多为有机酸、无机酸和黄酮类成分，主要在负离子模式下解析，因此本研究主要针对三味檀香散和广枣的负离子模式下离子流图进行解析。

3.2 三味檀香散和广枣的药效学研究结果

3.2.1 受试物对LPS 诱导的RAW246.7 细胞NO 分泌的影响 结果见图2，与模型组比较，广枣和三味檀香散含药血清均能显著抑制NO 分泌（P<0.01），且三味檀香散组细胞NO 分泌量显著低于广枣组（P<0.05）。

图2 三味檀香散和广枣对LPS诱导的Raw246.7细胞NO分泌的影响（,n=3）

3.2.2 受试物对H2O2诱导的H9c2 细胞氧化损伤的影响 实验结果见图3，与模型组比较，广枣和三味檀香散含药血清均能减轻H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤（P<0.01），且三味檀香散组抗氧化损伤作用显著低于广枣组（P<0.01）。

图3 三味檀香散和广枣对H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤的影响（,n=3）

3.2.3 受试物对苯肼诱导的斑马鱼血栓模型的影响 实验结果见图4，与对照组比较，血栓模型组斑马鱼心脏红细胞染色较弱（P<0.01），尾静脉血栓明显，提示模型制备成功，见图4A、图4B。三味檀香散组斑马鱼心脏染色强度较模型组显著增强（P<0.01），但广枣组斑马鱼心脏染色强度与模型组比较差异无统计学意义，见图4C。血栓形成率分别为模型组24.7%、广枣组15.3%、三味檀香散组-29.6%（抑制血栓形成）；抗血栓药效分别为广枣组84.9%、三味檀香散组165.8%，见图4D、图4E。结果显示三味檀香散有较强抗血栓作用，广枣无抗血栓作用。

图4 三味檀香散和广枣对苯肼诱导的斑马鱼血栓模型的影响（,n=10）

3.3 灰色关联度分析

本实验中参考序列为RAW246.7 细胞NO 抑制率时，Δ(min)=0.007 2，Δ(max)=1.104 4，参考序列为H9c2 细胞活性时，Δ(min)=0.199 5，Δ(max)=1.208 4。r计算结果见表2。当r>0.6 认为化合物对相应药效有贡献，广枣中对H9c2 细胞氧化损伤r>0.6的化合物有10个，r由大到小依次为儿茶素、柚皮素、3,8-二-O-甲基鞣花酸-2-O-葡萄糖苷、3,3ʹ-二氧甲基鞣花酸、槲皮素、槲皮素-3-鼠李糖苷、甲基鞣花酸葡萄糖苷、6-羟基吲哚乳酸、柠檬酸甲酯、柠檬酸三乙酯。广枣中仅柚皮素、儿茶素对RAW246.7细胞释放NO 抑制率有贡献，关联度分别为1.000 0和0.840 6。

表2 三味檀香散中化学成分的谱-效灰色关联度分析

4 讨论

复方新药中各药味的多元药效取其与适应证相关的功效，所谓用其所长，并在配伍环境中发挥协同作用。其药效物质基础亦随之关联，进而作为制备工艺（有效性获取）和质量标准制定的依据。本研究通过HPLC-Q-Exactive-MS/MS 检测到三味檀香散中48 个成分，其中以木脂素为主，有机酸、酚酸、黄酮次之，还有少量萜类和氨基酸成分；广枣中22 个成分，以有机酸、酚酸、黄酮成分为主。其中黄酮类成分柚皮素对心肌缺血再灌注损伤具有明显的保护作用，可通过上调PI3K/Akt/Nrf2 通路促进血红素加氧酶-1（HO-1）、醌氧化还原酶1（NQO1）、超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化物质的表达和活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）等氧化物质的清除[9]。儿茶素能改善老年冠心病大鼠血管内皮功能，调节丝裂原活化的细胞外信号调节激酶/细胞外调节蛋白激酶（MEK/ERK）信号通路，抑制大鼠机体炎性因子[10]。通过灰色关联度法对广枣和三味檀香散中色谱图峰面积和药效数据进行分析，发现儿茶素、柚皮素与抗炎、抗心肌氧化损伤药效关联度均大于0.8，表明儿茶素和柚皮素可能是广枣在三味檀香散方剂中发挥抗炎、保护心肌细胞的主要药效成分。

通过药效实验发现，广枣保护心肌细胞功效优于三味檀香散，抗炎作用次于三味檀香散，广枣对斑马鱼血栓没有显著影响。三味檀香散中三味药材等量入药，说明广枣在抑制心肌氧化损伤方面和抗炎方面发挥重要作用。而三味檀香散抗血栓、抗炎功效强于广枣，则可能是三味檀香散中肉豆蔻和檀香的成分起到协同作用。研究表明，肉豆蔻中挥发油成分能明显减慢心率、降低心律失常发生率，肉豆蔻中四氢呋喃类木脂素machilin B 能活化丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），治疗2 型糖尿病等代谢综合征；丁香酚是苯丙烷类的酚类化合物，是肉豆蔻挥发油的重要成分，有研究表明丁香酚可以抑制LPS诱导的炎症信号传导，减少NO、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、核转录因子-κB（NF-κB）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达，且可以减轻大鼠缺血/再灌注（I/R）损伤[11]；苯并四氢呋喃类木脂素myrisfrageal B 能抑制NO，发挥抗炎作用[12]。檀香中α-檀香醇、β-檀香醇是檀香挥发油的主要成分，具有中枢镇静作用，反式-4-羟基脯氨具有抗氧化、调节脂肪乳化、抗菌、抗肿瘤、抗高血压等作用[13]。但由于肉豆蔻与檀香均以挥发油成分为主，在HPLC-Q-Exactive-MS/MS 不易测定，后续需要进一步研究。

综上分析，本研究通过灰色关联度分析法得到广枣的谱效关联性，探讨了广枣在三味檀香散中的配伍作用，初步衡量各成分对药效的贡献程度，可为研究三味檀香散药效物质基础与质量控制提供依据。