申应德,巩长芹,王家芳,丁勃,张新,李学红
1.临沂市检验检测中心,山东 临沂 276000;2.山东省食品药品检验研究院,山东 济南 250101
翻白草是我国的传统药材,始载于《救荒本草》,为蔷薇科委陵菜属植物翻白草Potentilla discolorBge.的干燥全草。其味甘、微苦,性平,具有清热解毒、止痢、止血等功效,常用于湿热泻痢、痈肿疮毒等证[1-2]。现代研究表明,翻白草含有黄酮、萜、甾体、鞣质及有机酸等多类化学成分,具有抗菌、止泻、抗肿瘤、免疫抑制等药理作用,且能有效治疗2 型糖尿病[3-5]。近年来,随着翻白草治疗糖尿病研究的不断深入,临床对其需求不断增加。但市场上翻白草饮片质量参差不齐,甚至存在将委陵菜充当翻白草使用的情况,疗效难以得到保障[6]。委陵菜为蔷薇科委陵菜属植物委陵菜P.chinensisSer.的干燥全草,与翻白草同科同属,属于近缘物种,因其产地、外观性状等相似,所以在许多地区都存在混用现象,存在较大用药安全隐患。
传统的中药材鉴定方法主要是基于性状、显微结构及理化特征。分子生物学技术的不断发展为中药材鉴定提供了新的思路。目前,比较适用的中药DNA 分子鉴定方法,如位点特异性聚合酶链式反应(PCR)法、限制性片段长度多态性PCR(PCRRFLP)法及DNA 条形码分子鉴定法均已收录于《中华人民共和国药典》2020 年版[7]153-155。DNA 条形码的概念由Hebert等[8]首次提出,是指利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA 序列进行物种鉴定的一种分子生物学技术,是传统形态鉴别方法的有效补充,具有操作简单、重复性高等特点,尤其适合药用植物鉴定[7]490-492。2010 年,Chen 等[9]对6000 余份药用植物样本进行DNA 条形码序列筛选,首次提出以内转录间隔区2(ITS2)为核心、psbA-trnH为补充序列的药用植物条形码鉴定体系。近年来,已有多篇文献报道可以利用ITS2 对中药材基原进行准确鉴别[10-13],表现出独特的鉴定能力优势,得到了很好的验证。
迄今,已有多位学者从植物性状、理化成分对翻白草和委陵菜作了详细鉴别,但未见有关翻白草、委陵菜分子鉴定的报道[6,14-15]。本研究以翻白草及其常见易混品委陵菜为研究对象,收集翻白草及委陵菜样品共30 批,基于ITS2 序列的DNA 条形码技术构建两者的分子生物学鉴定方法,为准确鉴别翻白草及委陵菜、保障临床安全用药提供有效手段。
Mikro 200R 型高速冷冻离心机(Hettich 公司);C1000 型PCR 扩增仪、Mini-Sub cell GT 型水平电泳仪、Gel DocXR+型凝胶成像系统(Bio-Rad 公司);NanoDrop 2000 型超微量紫外分光光度计(Thermo公司)。
DNeasy Plant Mini Kit 植物基因组DNA 提取试剂盒(Qiagen 公司);2×TaqPCR 预混试剂Ⅱ[天根生化科技(北京)有限公司];DL1000 DNA Marker(TaKaRa 公司);ITS2 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
翻白草对照药材(FR,批号:121162-201704)、委陵菜对照药材(WR,批号:121021-201803)均购自中国食品药品检定研究院;翻白草(编号1~11)为2021 年山东省药品质量风险监测抽检样品;翻白草(编号F1~F3)、委陵菜(W1~W14)均为日常收集样品。样品经临沂市检验检测中心中药检验室副主任药师巩长芹鉴定,分别为蔷薇科委陵菜属植物翻白草Potentilla discolorBge.的干燥全草、蔷薇科委陵菜属植物委陵菜P.chinensisSer.的干燥全草。
从GenBank数据库下载翻白草ITS2序列(登录号分 别为MH349344.1、KR611768.1、MG730293.1、GQ434650.1、FJ980389.1)、委陵菜ITS2序列(登录号分别为MH349339.1、MG730958.1、MH349334.1、KR611747.1、OM180098.1)各5 条,用于序列分析及构建分子进化树。
取样品约2 g,充分研磨至细粉。取细粉约30 mg,按照植物基因组DNA 提取试剂盒操作步骤提取DNA。用NanoDrop 2000 型超微量紫外分光光度计测定DNA 浓度,并用灭菌水将其稀释至10~20 ng·μL-1,作为PCR反应模板。
PCR 反应体系为25 μL,包括2×PremixTaq12.5 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL、模板2 μL,补加灭菌水至25 μL。PCR 扩增用引物序列为ITS2F(5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′)、ITS3R(5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′)。PCR 扩增程序为94 ℃、5 min;94 ℃、30 s,56 ℃、30 s,72 ℃、45 s,40个循环;72 ℃、10 min。
PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后,进行双向测序。测序委托生工生物工程(上海)股份有限公司。
应用SeqMan软件去除测序峰图两端的低质量区及引物序列,并完成校对和拼接。基于隐马尔科夫模型的HMMer 注释方法[16]去除两端5.8S 和28S 区段,获得ITS2序列。
利用EMBOSS Needle 在线双序列比对FR、WR的ITS2 序列,比较两者序列差异。根据Koetschan等[17]建立的ITS2 数据库及网站预测ITS2 二级结构。利用MEGA X 进行多序列比对,计算翻白草及委陵菜平均鸟嘌呤(G)+胞嘧啶(C)占比,分析种内序列变异位点,确定不同的单倍型。相同序列即为同一个序列类型,任意碱基位点有变异者均分别列为不同的序列类型[18]。选择K2P(Kimura 2-parameter)模型,计算种内和种间距离,采用邻接法(NJ)构建系统进化树。
结果表明,所有样品均成功提取到基因组。测定各样品在260、280 nm 处的吸光度(A),发现大多数样品A260nm/A280nm<1.6,提示DNA 提取过程中存在蛋白质污染。
将PCR 产物进行凝胶电泳,结果显示所有实验样本PCR 产物均有大小约500 bp 的单一条带,且条带较亮,没有拖尾现象。说明模板中存在的少量蛋白质污染并没有对PCR 实验产生明显干扰。PCR 反应产物分次凝胶电泳图见图1。
图1 翻白草与委陵菜样品PCR产物琼脂糖凝胶电泳图
将FR与WR的ITS2 进行双序列比对,结果显示两者序列长度均为210 bp,但相似性仅为92.9%,有15个碱基位点存在不同,差异明显(图2)。
图2 FR与WR的ITS2序列双序列比对
采用ITS2 序列在线数据库(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/)对FR与WR的ITS2 序列进行二级结构预测,结果见图3。翻白草的ITS2序列二级结构由1 个规整的中心环(loop)和4 个螺旋区(helix)组成,每个螺旋区上又有大小不等、数目各异的茎环结构。而委陵菜ITS2 序列二级结构的中心环并不规整,存在明显的3 个凸起部分,且Ⅳ螺旋区的茎环数目与翻白草差异明显。因此,可以通过ITS2序列的二级结构直观区分两者。
图3 FR与WR的ITS2二级结构
翻白草ITS2 序列共20 条,平均G+C 占比为63.0%,种内K2P 遗传距离为0~0.009 6,有3 个单倍型,存在2 个变异位点,分别为第37 位的C/G 和第163 位的C/T(表1)。委陵菜ITS2 序列共20 条,平均G+C 占比为64.4%,种内K2P 遗传距离为0~0.019 3,有7 个单倍型,存在5 个变异位点,分别在第96 位A/C、第156 位C/A、第165 位C/G、第170 位C/T 及第191 位G/A。这说明,翻白草种内具有更为保守的ITS2序列,种内变异更小。
表1 翻白草及委陵菜种内ITS2序列变异分析
翻白草与委陵菜种间K2P 遗传距离为0.054 8~0.075 8,远大于种内最大遗传距离,具有明显的条形码间距,说明K2P距离可很好地区分两者。
作为DNA 条形码鉴别序列,既要有足够的种间变异,可将不同物种区分开来,同时又有较小的种内变异,可将同一物种聚为一类[19]。从图4 上看出,翻白草和委陵菜明显地聚为不同的一支,且各支的支持率bootstrap值较高,可明显区别。
图4 基于ITS2序列构建的翻白草及委陵菜NJ树
植物细胞内存在大量的多糖、酚、蛋白质等次生代谢产物,这些物质与DNA 共沉淀易形成黏稠的胶状物,影响了DNA 的提取质量[20]。本研究采用试剂盒法提取30份样品的DNA,结果显示大多数样品DNA 的A260nm/A280nm<1.6。原则上,用于PCR 的DNA模板A260nm/A280nm在1.8~2.0为宜。为了提高模板的质量,对DNA 提取过程进行了改进探索,如增加三氯甲烷去蛋白质步骤、延长离心沉淀时间、改变裂解条件为56 ℃过夜[21]等。这些条件的改变,部分提高了样品DNA 的浓度,但对纯度没有明显改善。琼脂糖凝胶电泳及测序表明,所有样品均扩增出ITS2 序列,低A260nm/A280nm值未对ITS2 序列的PCR 扩增产生影响,显示出该方法具有较好的耐用性。
基于基因序列差异的比较为中药材鉴定提供了最本质的依据。作为当前生物分类学鉴定研究中的热门方向,DNA 条形码技术在基因水平上对物种标记进行鉴定,不受植物生长发育阶段、取样部位及环境因素的影响,避免了主观人为的判断和客观条件的影响,是对传统中药鉴定方法的有效补充[22-24]。植物DNA 条形码研究经历了大量叶绿体片段(如rbcL、matK、trnH-psbA等)、核糖体基因ITS/ITS2及多种片段组合的筛选验证阶段[25]。近年来,Chen等[9]通过对大量药用植物样本进行深入研究和分析,最终确定将ITS2 作为鉴别药用植物及其近缘种的标准DNA 条形码,同时也推荐叶绿体基因间隔区片段psbA-trnH作为补充条形码,这为中药快速、准确的鉴定打下了基础。
本研究以翻白草及其常见易混品委陵菜为研究对象,收集翻白草及委陵菜样品共30 批,提取样品的DNA,进行ITS2序列扩增、测序、拼接,对序列的长度、二级结构、G+C 占比、序列变异、遗传距离及分子进化树等进行分析,表明基于ITS2 序列的DNA 条形码技术可以准确鉴别翻白草及委陵菜,为保障临床安全用药提供参考。