不同产地干、鲜粉葛 HPLC 指纹图谱及6种成分含量测定

谢雪勤 李志杰 吴静宜 邓欣 洪玉冰 车彦云 赵毅

【摘 要】   目的： 比較不同产地干、鲜粉葛中化学成分及对其中葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷和大豆苷元 6 种异黄酮类成分的含量进行测定。 方法： 选用 Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），甲醇－0.2%冰乙酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，紫外检测波长为 250 nm。利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版）”软件处理色谱数据，建立了粉葛指纹图谱，同时进行相似度评价。另外，采用 HPLC对 6 种成分进行了含量测定。 结果： 建立了粉葛的指纹图谱，共标定了 26 个共有峰，指认了 9 种成分，分别是 3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素及芒柄花素。对其中 6 种指认的成分进行含量测定，发现各地葛根素含量最多。各地鲜品葛根素平均含量为 4.48 mg/g，各产地含量排名前三依次是：文山＞丽江＞红河，各产地6 种异黄酮总含量排名前三依次是：红河＞文山＞丽江；不同产地 6 种异黄酮总含量均是鲜品大于烘干粉葛。 结论： 不同产地粉葛干、鲜的化学成分较相似，但含量存在明显差异，且鲜品粉葛中 6 种异黄酮总含量高于干品，可为粉葛资源的相关开发利用提供有效的科学依据。

【关键词】  指纹图谱；粉葛；异黄酮；含量测定

【中图分类号】R932   【文献标志码】A    【文章编号】1007-8517（2023）13-0023-06

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.13.zgmzmjyyzz202313006

HPLC Fingerprints of Dry and Fresh   from Different Areas and Determination of Six Components

XIE Xueqin1，2 LI Zhijie1，2 WU Jingyi1，2 DENG Xin1，2 HONG Yubing1，2 CHE Yanyun1，2 ZHAO Yi1，2*

1. College of Pharmaceutical Science， Yunnan University of Chinese Medicine， Kunming 650500， China;

2.Engineering Research Center for Homology of Medicine and Food Beverage of Yunnan Province， Kunming 650500，China

Abstract：  Objective  To compare the chemical constituents of dried and fresh different producing area and determine the contents of six isoflavones， including Puerarin， 3′-MethoxyPuerarin， Puerarin apioside， Daidzin， Genistin and Daidzein. Methods  The Symmetry C18 column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used with methanol-0.2%glacial acetic acid aqueous solution as the mobile phase for gradient elution， and the ultraviolet detection wavelength was 250 nm. The chromatographic data were processed by the software of “ Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of Chinese Materia Medica （version 2.0）”， and the fingerprints of Pueraria thomsonii were established and the similarity was evaluated. In addition， the contents of the six components were determined by HPLC. Results  HPLC fingerprints of Pueraria thomsonii were established. A total of 26 common peaks were identified， and 9 components were determined， namely 3′- Hydroxy Puerarin， Puerarin， 3′-Methoxy Puerarin， Puerarin apioside， Daidzin， Genistin， Daidzein， Genistein and Formononetin. The contents of six identified components were determined， and it was found that the content of puerarin was the highest in all places. The average content of puerarin in fresh samples is 4.48 mg/g， and the top three contents in each producing area are Wenshan > Lijiang > Honghe， and the top three total contents of six isoflavones in each producing area are Honghe > Wenshan > Lijiang. The total contents of six isoflavones from different origins were higher in the fresh products than in the dried Pueraria thomsonii.  Conclusion  The chemical components of dried and fresh Pueraria thomsonii from different habitats are similar， but there are obvious differences in their contents. In addition， that total content of the six isoflavone in the fresh  Pueraria thomsonii is higher than that of the dry Pueraria thomsonii， which can provide effective scientific basis for the related development and utilization of Pueraria thomsonii resources.

Key words： Fingerprint; Pueraria thomsonii; Isoflavone; Content Determination

粉葛是豆科植物甘葛藤 Pueraria thomsonii  Benth.的干燥根，具有解肌退热、生津止渴、透疹、升阳止泻、通经活络、解酒毒等功效［1］。粉葛在2005年于《中国药典》中与葛根分开记载，药典规定葛根正品药用植物有葛根与粉葛，其有效成分主要为异黄酮类［2］，而其中以葛根素、大豆苷元和染料木素等为主［3］。研究［4-8］表明，葛根具有解酒护肝、降血糖、降血压、抗炎、抗凋亡和抗氧化等药理活性。

中药鲜药的研究也有众多讨论，鲜药的使用体现了极高的价值［9-12］。葛根鲜用也有悠久的历史，《圣惠方》中记载鲜葛捣汁可治鼻衄；葛洪在《肘后备急方》中也记载：“捣鲜葛根，以水煮，去滓，温服，治金疮中风”“治服药失度，心中苦烦，饮生葛根汁大良。”目前对粉葛研究主要以饮片为主，且主要集中于化学成分、药理活性、临床应用等方面，对鲜品涉及较少，干、鲜品粉葛化学成分的差异也少有报道。

本实验通过对粉葛干品、鲜品的异黄酮类成分建立指纹图谱，并对其中的葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷和大豆苷元6种成分进行含量测定，以期为粉葛后续相关临床应用及药理药效考察提供参考。

1 材料、仪器与试剂

1.1 材料 11种粉葛样品分别于2022年5～6月采集和购买于云南省、贵州省、广西省、湖北省。

1.2 仪器 高效液相色谱仪（SHIMADZU LC-2030，日本岛津公司）；分析天平（ AR224CN 型，奥豪斯仪器有限公司）；超纯水机（VE-10LH-A，深圳市洪森环保科技有限公司）；电热鼓风干燥箱（101-3AB，天津市泰斯特仪器有限公司）；超声波清洗器（SK5200HP，上海科导超声仪器有限公司）；冰箱（ BCD-610W，西门子股份公司）。

1.3 试剂 粉葛（购自德阳远知药材经营部，由云南中医药大学中药学院邱斌正高级工程师鉴定为豆科植物甘葛藤  Pueraria thomsonii  Benth. 的根）；对照品：3′-羟基 葛根素（3′-HydroxyPuerarin）、葛根素（Puerarin）、3′-甲氧基葛根素（3′-MethoxyPuerarin）、葛根素芹菜糖苷（Puerarin apioside）、大豆苷（Daidzin）、染料木苷（Genistin）、大豆苷元（Daidzein）、染料木素（Genistein）和 芒柄花素（Formononetin），均购于德斯特生物技术有限公司（纯度≥98.0%）。色谱甲醇（美国Sigma公司），其它试剂为分析纯。

1.4 原料的制备 将11个产地的新鲜粉葛洗净，去除表面泥沙，分为两份，一份冻干，一份于60 ℃烘干（水分符合《中国药典》2020年版要求），具體信息见表1，粉碎，过三号筛后保存备用。

2 试验方法与结果

2.1 色谱条件 Symmetry C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm， 5 μm），以甲醇－0.2%冰乙酸水溶液作为流动相梯度洗脱（见表 2），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长250 nm；进样量：10 μL。

2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素及芒柄花素，置于5 mL容量瓶中， 用40%甲醇溶解，定容。吸取各对照品溶液适量，置于10 mL容量瓶中，用40%甲醇定容，制得各质量浓度分别为0.7252 mg/mL、0.3332 mg/mL、0.4508 mg/mL、 0.3332 mg/mL、0.5096 mg/mL、0.5684 mg/mL、0.5488 mg/mL、0.4508 mg/mL、0.6468 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试溶液的制备 分别精密称取冻干与60 ℃干燥的粉葛粉末约1.6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入40%甲醇50.0 mL，称重，超声提取30 min，放冷，补足失重，摇匀， 以3500 rpm离心 15 min，取上层清液，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性考察 取“2.2”项下对照品溶液0.1 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、5 mL，分别置于10 mL量瓶中，以40%甲醇定容至刻度，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分的含量为横坐标（ X）、峰面积为纵坐标（Y ）进行线性回归，见表3。

2.4.2 精密度试验 精密吸取对照品混合溶液10 μL，重复进样 6 次测定，以峰面积计算连续进样测定6次，以葛根素为参照，计算各色谱峰峰的相对峰面积。结果表示3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素及芒柄花素的RSD值分别为0.07%、0.07%、0.04%、0.06%、0.07%、0.10%、0.11%、0.03%、0.02%，表明该方法精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 精密吸取对照品混合溶液10 μL，分别在0 h、1 h、4 h、6 h、10 h时进行测定，分别计算3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素及芒柄花素 的RSD值分别为0.06%、0.08%、0.05%、0.07%、0.06%、0.09%、0.11%、0.02%、0.01%， 表明该方法稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取同一批样品，平行配制6份供试品溶液， 进样10 μL。分别计算3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素及芒柄花素的RSD值，结果分别为1.83%、1.49%、0.75%、0.68%、2.35%、1.19%、1.48%、2.26%、2.48%， 表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验  取已知含量的干品（编号S4，60 ℃烘干）6份，每份约0.8 g，加入含量相当的对照品溶液（按“2.2”项下方法配制），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算平均回收率和RSD。结果显示，葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷和大豆苷元的平均加样回收率分别为100.50%、101.41%、99.51%、101.85%、100.18%、99.33%，RSD分别为0.81%、1.09%、1.18%、1.47%、1.07%、1.25%（表4）。

2.5 干、鲜粉葛指纹图谱的生成及相似度评价 取11批粉葛干、鲜样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进行测定，将图谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2.0版）》。以S4样品图谱为参照，生成干（A）、鲜（B）粉葛HPLC指纹图谱和各自对照指纹图谱（R），如图1所示。采用Mark峰匹配，共得到26个共有峰。通过比对混合对照品色谱图（D），确定10、13、14、15、18、19、23、24、26号峰分别为3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素及芒柄花素。

对11批粉葛干、鲜样品进行相似度评价。图A S1～S11 批干品与对照指纹图谱的相似度在0.721～0.995之间，其中嵩明与贺州相似度分别为0.721与0.779，其余产地相似度均大于0.9；图 B S1～S11 批鲜品与对照指纹图谱的相似度在0.939～0.989之间，表明各产地粉葛之间差异性较小。

2.6 6种差异性成分的含量测定 取11批粉葛干、鲜样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，并计算6种差异性成分葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷和大豆苷元的含量。不同产地的粉葛 6 种异黄酮成分含量差异较大，各地葛根素含量最多。各地冻干鲜品葛根素平均含量为4.48 mg/g，各产地含量排名前三依次是：文山＞丽江＞红河，6种异黄酮总含量，各产地含量排名前三依次是：红河＞文山＞丽江；不同产地6种异黄酮总含量均是冻干鲜品大于烘干。该差异可能是与地域、气候、采收期以及运输过程中的储存方式相关。见表5。

3 讨论

鲜药是药材经采收后直接使用的特殊的中药材［13］，中药鲜药的应用具有悠久的历史，最早在《五十二病方》中就有关于鲜药应用的记载［14］。据统计，临床常用药中有480种可用鲜品治疗疾病［15］。由于鲜药受到产地、时节及保鲜技术等因素的影响，市场上中药材多用干品。粉葛作为药食两用资源，鲜葛寒凉清热作用较干葛强，可治疗温病发热、血热吐衄、 津伤口渴等血热病［16］。市场上粉葛不论作为药品或者食品均是以干品或提取物居多，但粉葛作为鲜药使用也具有很高的价值。

本实验通过对不同产地的粉葛干品、鲜品建立指纹图谱并进行相似度评价发现，不同产地粉葛化学成分无明显差异，粉葛干品与鲜品化学成分也无明显差异；但比较其葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、染料木苷和大豆苷元6种异黄酮成分含量，不同产地的粉葛6种异黄酮成分含量差异较大，各地葛根素含量最多；干品与鲜品6种异黄酮成分总含量也较大，均是鲜品大于烘干粉葛。各地鲜品葛根素平均含量为4.48 mg/g，各产地含量排名前三依次是：文山＞丽江＞红河，6种异黄酮总含量，各产地含量排名前三依次是：红河＞文山＞丽江。因为样品均为药材公司提供，考虑其地域、气候、采收期以及运输过程中的储存方式等因素，所得结果还需进一步验证。

参考文献

［1］中国药典委员会.中华人民共和国药典：2020年版一部［S］.北京：中國医药科技出版社，2020：302.

［2］朱卫丰，李佳莉，孟晓伟，等.葛属植物的化学成分及药理活性研究进展［J］.中国中药杂志，2021，46（6）：1311-1331.

［3］楚纪明，马树运，李海峰，等.葛根有效成分及其药理作用研究进展［J］.食品与药品，2015，17（2）：142-146.

［4］JIANG B， YANG W， CHEN L， et al. In vitro effects of Pueraria extract on ethanol-exposed microglia and neurons［J］. Biomed Pharmacother， 2020（127）： 110163.

［5］钟凌云，邓小燕，黄艺，等.葛（葛根、粉葛）不同炮制品的药效与肠道菌群研究［J］.中国中药杂志，2021，46（17）：4403-4409.

［6］SRIVASTAVA S， PANDEY H， SINGH S K， et al. Anti-oxidant， anti-apoptotic， anti-hypoxic and anti-inflammatory conditions induced by PTY-2 against STZ-induced stress in islets［J］. Biosci Trends， 2019，13（5）： 382-393.

［7］ZHAO W， PENG D， LI W， et al. Probiotic-fermented Pueraria lobata （Willd.） Ohwi alleviates alcoholic liver injury by enhancing antioxidant defense and modulating gut microbiota［J］. J Sci Food Agric， 2022，102（15）：6877-6888.

［8］SATPATHY S， PATRA A， AHIRWAR B， et al. Antioxidant and anticancer activities of green synthesized silver nanoparticles using aqueous extract of tubers of Pueraria tuberosa［J］. Artif Cell Nanomed B， 2018， 46（sup3）： S71-S85.

［9］韩东，王珊，王乐，等.基于中国知网数据库（1978-2020年）中药鲜药鲜用研究的知识图谱及数据可视化分析［J］.世界科学技术-中医药现代化，2022，24（11）：4140-4148.

［10］  吴珊珊.鲜药消渴汤治疗2型糖尿病（气阴两虚证）的价值［J］.北方药学，2022，19（10）：182-184.

［11］葛跃，王凤姣.鲜药消渴汤治疗气阴两虚2型糖尿病的临床效果及对患者睡眠质量的影响［J］.世界睡眠医学杂志，2021，8（11）：1919-1920.

［12］郝近大.鲜药发展的历史沿革［J］.首都医药，2009，16（21）：42-44.

［13］彭孟凡，田硕，苗晋鑫，等.中药鲜品的应用、存在问题及未来发展［J］.中医杂志，2021，62（14）：1200-1204.

［14］郑远军，张琳琳，彭智平.鲜药探究［J］.新中医，2015，47（1）：252-253.

［15］郭晓宇，杜捷.鲜药在临床应用优势中的探索［J］.中国临床医生杂志，2015，43（9）：91-93.

［16］孙振国，吴立明.几种常用中药鲜药本草考述［J］.国医论坛，2013，28（1）：50-52.

（收稿日期：2022-03-08 编辑：刘 斌）