真空浸渍辅助BTH-Ca2+复合处理对甘薯采后愈伤能力的影响

宣红霞, 管玉格, 郑 剑, 庞林江, 陆国权, 成纪予

(浙江农林大学食品与健康学院,杭州 311300)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam]体积大、水分高,皮薄肉嫩,在采收和流通环节极易发生割伤、碰伤、擦伤等机械损伤。损伤甘薯表面的伤口不仅加速水分蒸发,而且是病原菌入侵的最佳通道。据统计,每年大概有15%的甘薯因储藏不当而腐烂,其中因机械损伤而导致病原菌侵入引起的腐烂占总损失50%以上[1]。甘薯受到损伤后,会激发体内自我防御系统的响应,启动自愈功能,在伤口处形成愈伤组织,有效地防止水分流失和病菌入侵[2-4]。甘薯伤口自愈时间一般需要2～3周,在长时间愈伤过程中,甘薯的品质易受外界因素影响而劣变。目前,可通过热处理或化学药剂处理加快甘薯愈伤。热处理愈伤如热空气、热水和微波处理等有利于甘薯伤口周皮的形成[5,6],但处理时需要有相应加热设施,实际应用时存在操作不便、能耗大、不易受热均匀等问题。适宜浓度的化学药剂如脱落酸(ABA)[1]、苯丙噻重氮(BTH)[7]、一氧化氮(NO)[8]等均能加速甘薯的愈伤,有处理简便、设备投资少等优点,但是仅使用单一药剂容易存在效果不明显、不稳定等问题,因此,开发更高效的复合药剂将有更好的推广前景。

BTH为水杨酸(SA)类似物,是一种人工合成的植物诱导抗病剂,安全性高,不管采前还是采后使用对果蔬病害的防治效果良好[9,10]。BTH诱导抗病性的增强与其促进植物体内木质素含量的增加有关[11]。它通过提高PAL、C4H、4CL、CAD等苯丙烷代谢关键酶活性,促进酚类、类黄酮、木质素等产物的合成和累积,起到加快甘薯[7]、马铃薯[9]、梨[12]、甜瓜[13]等采后愈伤进程的作用。钙在植物细胞壁组成、细胞膜结构和功能的维持以及提高植物抗性方面发挥着重要的作用[14]。外源Ca2+处理也可激发苯丙烷代谢,增加木质素含量,提高愈伤效率和抗病能力[15]。研究还表明,Ca2+对外源诱抗剂诱导植物体内木质素含量的合成调控具有增强作用[16]。目前,将BTH-Ca2+复合处理应用于促进甘薯采后愈伤的研究鲜有报道。

真空浸渍是真空处理与传统浸渍相结合的一种高效技术,具有提升浸渍效率、增强浸渍效果的作用[17]。“心香”甘薯食味细腻可口,品种优良,但薯皮很薄,极其容易受损伤。结合真空浸渍技术,以“心香”甘薯为研究对象,进行人工机械损伤,以木质素含量为指标,通过单因素和响应面优化实验,建立可信的数学模型,获得BTH-Ca2+复合处理对甘薯愈伤的最佳工艺参数,探究最佳处理条件下甘薯愈伤部位木质素合成及其相关酶活性之间的关系,以期为甘薯采后的快速愈伤提供一种可靠的技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘薯品种：心香,由浙江农林大学薯类作物研究所合作基地提供。挑选性状一致、大小均匀、无机械损伤和病害的甘薯为实验材料。

试剂：BTH、乳酸钙、次氯酸钠、硼酸、硼砂、L-苯丙氨酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、乙二胺四乙酸(EDTA)、β-巯基乙醇、愈创木酚、过氧化氢(H2O2)、乙酸、乙酸钠、Triton X-100、聚乙二醇6000(PEG 6000)、高氯酸、盐酸、氯化镁、维生素C(VC)、亮抑酶肽(Leupeptin)、甘油、苯甲基磺酰氟(PMSF)、氧化型辅酶II二钠(NADPNa2)、D-葡萄糖-6-磷酸二钠盐(G6-pNa2)、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、反式肉桂酸、烟酰胺腺嘌呤双核苷酸磷酸盐(NADP)、辅酶A、p-香豆酸、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)等均为分析纯。

1.2 仪器设备

HWS-250FT 智能低温冷藏箱,UNICO 2802紫外分光光度计,DGG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱,SIGMA 3K15离心机,TH-200Q超声波清洗器,HH-6恒温水浴锅,IKA A11 basic研磨机,SHB-IIIA真空泵。

1.3 方法

1.3.1 甘薯的损伤处理

将新鲜甘薯洗净,用体积分数1%～2%次氯酸钠溶液浸泡3 min消毒,用蒸馏水冲洗后晾干。用已消毒不锈钢刮皮刀在甘薯表面赤道部位削出3个长×宽×深约为20 mm×10 mm×2 mm的伤口。

1.3.2 甘薯的愈伤处理

将人工损伤后甘薯完全浸入溶液中(料液比1∶2,m/V),再将其置于真空浸渍装置内进行愈伤处理,见图1。浸渍处理好的甘薯取出自然风干,置于室温(25 ℃)、相对湿度80%～85%的黑暗环境中进行愈伤。

图1 真空浸渍装置

1.3.3 取样

在前期实验基础上,根据木质素的累积情况,在愈伤的0、1、2 d时分别取样,每处理每次取样甘薯10个,用已消毒不锈钢小刀取甘薯伤口及伤口下2 mm厚的愈伤组织[18],快速液氮冷冻,使用研磨机研成粉末,密封保存于-80 ℃,待测。

1.3.4 单因素实验

以木质素含量为指标,分析不同的BTH浓度(0、50、100、150、200 mg/L)、乳酸钙浓度(0、5、10、15、20、25 g/L)、真空度(5、10、15、20、25、30 kPa)和浸渍时间(2、4、6、8、10 min)对甘薯愈伤效果的影响。

1.3.5 响应面优化实验

根据单因素实验结果,从BTH浓度(A)、乳酸钙浓度(B)、真空度(C)、真空时间(D)4个因素中,分别选取3个对甘薯愈伤效果影响较大的水平,以木质素含量为响应值,根据 Box-behnken 实验设计原理,确定响应面实验方案,并建立回归方程进行预测,影响因素与水平见表 1。

表1 响应面实验因素与水平

1.4 测定方法

1.4.1 木质素含量

采用试剂盒检测。称取1.0 g样品,在80 ℃下烘干至恒重,碾磨后过40目筛,然后按照试剂盒的说明进行检测。反应结束后在280 nm处测定吸光值,实验结果以干质量计,单位为mg/g。

1.4.2 PAL活性

参考Wang等[7]的方法并略作修改。准确称取1.0 g样品,加入5 mL经4 ℃预冷的0.1 mol/L pH 8.8硼酸缓冲液(含质量分数40 g/L PVP、浓度2 mmol/L EDTA和浓度5 mmol/L β-巯基乙醇)充分混匀,于4 ℃,12 000 × g离心30 min,收集上清液即为粗酶液。反应体系为：3 mL 50 mmol/L pH 8.8硼酸缓冲液,加入0.5 mL 20 mmol/LL-苯丙氨酸,在37 ℃预保温10 min,再加入0.5 mL酶液,混合后迅速在290 nm测初始吸光度,然后将反应管置于37 ℃保温60 min,加入0.1 mL 浓度6 mol/L盐酸溶液终止反应,在290 nm测终止吸光度。以每小时吸光值变化0.01为1个活力单位(U),单位为U/g。

1.4.3 C4H活性

参考Jiang等[19]的方法并略作修改。准确称取1.0 g样品,加入3 mL经4 ℃预冷的pH 8.9 50 mmol/L Tris-HCI缓冲液(含4 mmol/L MgCl2,15 mmol/L β-疏基乙醇,质量分数0.15 % PVP,5 mmol/L VC,10%甘油,10 μmol/L Leupeptin和1 mmol/L PMSF),在冰浴条件下充分提取1 h,于4 ℃,12 000 × g离心20 min,收集上清液即为粗酶液。反应体系为：300 μL浓度2 mmol/L NADPNa2,100 μL酶液,300 μL 2 mmol/L G6-pNa2和300 μL浓度2 mmol/L 反式肉桂酸,混匀后25 ℃水浴30 min,结束后在340 nm测吸光度。以每分钟吸光值变化0.01为1个活力单位(U),表示为U/g。

1.4.4 4CL活性

参考Jiang等[19]的方法并略作修改。准确称取1.0 g样品,加入5 mL经4 ℃预冷的pH 8.9浓度50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(含4 mmol/L MgCl2,浓度15 mmol/L β-疏基乙醇,质量分数0.15 % PVP,5 mmol/L VC,体积分数10%甘油,10 μmol/L Leupeptin和1 mmol/L PMSF),在冰浴条件下充分提取1 h,于4 ℃,12 000 × g离心30 min,收集上清液即为粗酶液。反应体系为：0.15 mL 250 μmol/Lp-香豆酸、400 μL酶液、0.15 mL 50 μmol/L ATP、0.15 mL 15 μmol/L MgSO4、0.15 mL 1 μmol/L 辅酶A。在40 ℃下水浴10 min,取出后在333 nm处测定吸光度。以每分钟吸光值变化0.01为一个活力单位(U),表示为U/g。

1.4.5 CAD活性

参考Jiang等[19]的方法并略作修改。准确称取1.0 g样品,加入5 mL 4 ℃预冷的0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.25含β-巯基乙醇15 mmol/L、质量分数2%PEG 6000和质量分数1%PVP),在冰浴条件下充分提取1 h,在4 ℃,12 500 r/min下离心25 min,收集上清液即为粗酶液。反应体系：0.6 mL酶液和2.4 mL反应液(1 mL 2 mmol/L NADP,1.4 mL 1 mmol/L反式肉桂酸),在37 ℃下水浴30 min,然后加入200 μL 1 mol/L HCl终止反应,之后在340 nm测定吸光度。以每分钟吸光值变化0.01为1个活力单位(U),表示为U/g。

1.4.6 POD活性

参考Wang等[7]的方法并略作修改。准确称取1.0 g样品,加入5.0 mL乙酸-乙酸钠缓冲液(含1 mmol PEG 6000、4% PVP、1% Triton X-100),在冰浴条件下充分提取1 h,于4 ℃,12 000 × g离心30 min,收集上清液即为粗酶液。反应体系：3 mL 25 mmol/L愈创木酚溶液,0.5 mL酶液、200 μL 0.5 mol/L H2O2溶液迅速混合启动反应,在波长470 nm测吸光度,以每分钟吸光值变化0.01为1个活力单位(U),表示为U/g。

1.5 数据分析

每组实验重复≥3次,结果以平均值±SD表示;采用Design-expertV8.0.6.1进行响应面实验设计及方差分析;用SPSS 26进行显著性差异分析,数据统计采用Dunken’s统计分析,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 BTH浓度对甘薯愈伤的影响

木质素是甘薯愈伤组织的重要组成成分,与甘薯抗病性密切相关,木质素含量越高,其抗病性越好[20]。因此,外源处理通过促进甘薯伤口部位木质素的积累,可加速甘薯愈伤,增强其抗病性。由图1可知,不同浓度BTH处理均可不同程度地促进木质素合成,随着BTH浓度增加,甘薯伤口部位木质素含量呈先上升后略微下降的趋势,这可能是超过一定浓度时反而会降低甘薯伤口部位的可溶性糖含量[21],而糖类物质不仅可以提供能量,也是合成木质素的碳骨架[22],从而影响木质素的积累。结果表明,质量浓度100 mg/L BTH处理时,甘薯伤口部位木质素生成量最多(P<0.05),更有利于甘薯愈伤。

2.1.2 Ca2+浓度对甘薯愈伤的影响

钙处理可以诱导活性氧(ROS)积累,进而积累更多的木质素,提高植物体抵御病原菌的能力[23]。由图2可知,不同Ca2+浓度处理之间甘薯伤口部位木质素含量存在差异,随着Ca2+浓度的增加,木质素含量呈先上升后下降的趋势。当Ca2+质量浓度为15 g/L时,木质素含量的增加幅度最大(P<0.05),随着浓度继续增加,木质素含量反而降低,这可能是Ca2+过高浓度会改变甘薯伤口部位细胞质钙浓度,造成膜伤害,不利于合成木质素[24]。可见,适宜的Ca2+浓度作用下才能更好促进甘薯愈伤。

注：图中不同小写字母表示组间差异显著 ( P<0.05)。图2 BTH质量浓度、乳酸钙质量浓度、真空度、真空时间对甘薯木质素含量的影响

2.1.3 真空度对甘薯愈伤的影响

由图2可知,随着真空度的增加,甘薯木质素含量呈先平缓上升后逐渐下降的趋势。当真空度在15 kPa时,木质素的积累量达到最大值(P<0.05)。可见,在适当的真空度下,有利于外源BTH-Ca2+复合处理溶液的渗入,快速诱导甘薯伤口的响应机制,促进木质素的生物合成;但真空度过大,则会破坏细胞膜完整性,不利于细胞修复[25]。

2.1.4 真空时间对甘薯愈伤的影响

由图2可知,随着真空时间的增加,甘薯木质素含量呈先上升后下降的变化趋势。当真空时间为6 min时,木质素含量达到峰值;随着时间继续增加,木质素含量无显著性增加,时间过长反而略有降低(P>0.05),这可能是因为长时间的负压会导致细胞壁和膜完整性的破坏[26]。结果表明,合适的真空时间有助于提高甘薯愈伤的效率。

2.2 响应面优化结果

响应面优化方案及结果如表2所示,通过多元回归拟合,得到木质素含量对BTH质量浓度(A)、乳酸钙质量浓度(B)、真空度(C)和真空时间(D)的二次多项回归模型为：Y=178.12+2.64A-1.49B+14.89C+2.8D-0.98AB-4.58AC+1.92AD-3.32BC+5.35BD+11.85CD-13.59A2-4.57B2-5.5C2-17.01D2。

表2 响应面实验设计与结果

由表3可知,回归模型在统计学上极显著(P<0.01),失拟项不显著(P>0.05),R2=0.868 3,说明该模型拟合度良好,模型选择合理。其中,变量C、CD、A2、C2和D2对木质素含量的影响均极显著(P<0.01),各因素的主效应关系为：真空度>真空时间>BTH浓度>乳酸钙浓度。各因素两两之间交互作用明显,总的来说,随着BTH质量浓度、乳酸钙质量浓度、真空度及真空时间增加,木质素含量呈先上升后有略微下降趋势,说明在适宜的条件下处理才能更好地促进甘薯愈伤。

2.3 最优处理参数的验证

结合二次回归模型的分析结果,得到真空浸渍辅助BTH-Ca2+复合处理促进甘薯愈伤的最佳处理参数为：BTH质量浓度99.33 mg/L、乳酸钙质量浓度14.1 g/L、真空度15 kPa、真空时间6.76 min。考虑到实际操作的便利性,修正各参数为：BTH质量浓度100 mg/L、乳酸钙质量浓度14.1 g/L、真空度15 kPa、浸渍时间为6.5 min,在此条件下进行甘薯愈伤处理,木质素质量分数为195.06 mg/g,比理论值高2%左右。说明所建模型可靠,优化得到的处理条件可行。BTH-Ca2+复合处理下可加快木质素积累,但是两者复合处理的作用机制有待进一步解析。

2.4 处理对木质素合成及其相关酶活性的影响

木质素是苯丙烷代谢途径的代谢产物,能加强细胞壁的强度进而提高对病原菌的抵御能力[27,28]。由图3可知,受到机械损伤胁迫后,甘薯自身会激发防御响应,慢慢积累木质素,开启伤口自我愈合,这与马铃薯[29]、苹果[30]、番茄[31]等受到机械伤害时的应激反应变化趋势相一致。与对照组相比,经BTH-Ca2+复合处理的甘薯伤口部位木质素含量和PAL、C4H、4CL、CAD和POD活性的上升幅度均有所增加,表明愈合进程有所加快。愈伤2 d时,处理组木质素质量分数比对照组增加了33.6%(P<0.05),4CL、CAD和POD活性分别比对照组提高了12.6%、23.2%和53.2%(P<0.05)。吴觉天[32]、梁伟等[33]的研究表明,马铃薯、南瓜采后愈伤效果的提高与增强受损部位苯丙烷代谢途径有关,本实验得到类似的研究结果。因此,BTH-Ca2+复合处理可以通过激活甘薯愈伤期间的苯丙烷代谢,促进愈伤。

注：*表示组间存在显著差异(P<0.05)。

2.5 处理后木质素含量与相关酶活性的关系

已有研究表明,通过诱导调节苯丙烷代谢中PAL、C4H、4CL和CAD等关键酶的活性和基因表达,可增加木质素、酚类及其它抗菌物质的合成,抑制病原菌的侵染[34,35]。由表4可知,经BTH-Ca2+复合处理后,甘薯损伤部位的木质素含量及其相关酶活性之间均呈正相关,其中,木质素含量与PAL、4CL、CAD和POD活性之间呈极显著相关(P<0.01);PAL活性与CAD和POD活性呈极显著相关(P<0.01),与4CL活性之间呈显著相关(P<0.05);C4H活性与4CL和CAD活性之间呈显著相关(P<0.05);4CL活性与CAD和POD活性之间呈极显著相关(P<0.01)。根据相关性分析结果,进一步推测本实验处理可以通过提升木质素合成代谢关键酶的活性,促进木质素的积累,实现快速愈伤。

表4 木质素含量和总酚含量以及相关酶活性的相关分析

3 结论

外源处理可以加快甘薯损伤部位的木质素合成速率,提高愈伤能力。本实验通过单因素实验和响应面优化得到真空浸渍辅助BTH-Ca2+复合处理促进甘薯愈伤的工艺参数,对提升甘薯采后的储藏保鲜品质具有重要的指导意义和应用价值。结果表明,促进“心香”甘薯愈伤的最佳处理参数为：BTH质量浓度100 mg/L、乳酸钙质量浓度14.1 g/L、真空度15 kPa、真空浸渍时间为6.5 min,在此条件下愈伤2 d,木质素质量分数为195.06 mg/g,比对照组木质素质量分数高33.6%。同时,处理后的甘薯损伤部位苯丙烷代谢途径中PAL、C4H、4CL、CAD和POD活性均有所增强,与木质素含量呈显著的正相关性。可见,在本实验条件下,BTH-Ca2+复合处理通过激活苯丙烷代谢途径的活性,加速了甘薯对机械胁迫的快速应激反应,有利于木质素的合成与积累,从而提高甘薯采后的愈伤能力。