应用RT-PCR技术检测动物组织中的口蹄疫病毒

叶尔保勒,阿斯喀·夏热甫汉

伊宁海关技术中心,新疆 伊宁 835000

0 引言

口蹄疫主要由口蹄疫病毒而引起,该病毒为当前世界已知最小的动物病毒,主要发生于偶蹄兽中,是一种热性、急性传染病,具有高度接触性面源传染特点,患病动物口腔黏膜、乳房皮肤、蹄部和舌面部发生溃烂与水疱,因此也被称为口疮、蹄癀,一旦大规模发生将直接降低畜禽养殖质量和养殖场经济效益。而在众多病毒检测方法中,RT-PCR技术凭借高灵敏度、高特异性、易操作、一步法可检测大量样本、环境污染小等优势,被广泛应用于动物口蹄疫病毒检测中,以保证相关部门能在第一时间发现、清除与净化口蹄疫病毒,最终保证畜禽健康养殖,避免疫病流行。

1 RT-PCR技术简介

逆转录-聚合酶链反应(PCR),指提取细胞中的核糖核酸(RNA),以信使RNA(mRNA)作为模板,利用逆转录酶反转录成互补DNA(cDNA),进而进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,最终获得基因表达[1]。该检测方法能使RNA检测灵敏性提高几个数量级,多用于检测细胞中基因表达水平,同时,从RNA合成cDNA,之后扩增合成目片段,即可检测细胞中RNA病毒的含量,RT-PCR技术灵敏且用途广泛,与病原分离、血清学检测等方法相比,RT-PCR 方法具有直接、简单、快速等优势,不局限于实验室内进行诊断操作,在双重荧光定量 RT-PCR 方法应用下,可鉴别检测不同血清型口蹄疫灭活疫苗中的抗原含量和病毒因子,为口蹄疫疾病诊断与防疫打下坚实基础。

2 检测材料与方法

2.1 检测对象

本次检测选择4家养殖场不同猪、牛、羊群血清样本共300份(其中猪血清样本数104份,牛血清样本数102份,羊血清样本数94份)为例,对300头猪、牛、羊的水疱液样品进行检测,本次所应用到的生物试剂仪器、引物设计、检测过程如下。

2.2 检测试剂与仪器

1)生物试剂选择如下。①宝生物工程(大连)有限公司提供的荧光定量RT-PCR试剂盒、NdeⅠ限制性内切酶、Easy Dilution、6×Loading Buffer。②life公司提供的MEGAclearTM Kit RNA纯化试剂。③QIAGEN公司提供的总RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit。④Promega公司提供的pGEM-T载体试剂盒。⑤北京百奥莱博科技有限公司提供的RLT Buffer分子生物学试剂。⑥南通市海锐实验器材有限公司提供的EP管。⑦上海恪敏生物科技有限公司提供的TRlzol® Reagent试剂。⑧上海索莱宝生物科技有限公司提供的Binding Buffer-200 mL。⑨上海信裕生物技术有限公司提供的SPW Wash buffer-25 mL。上海泽叶生物科技有限公司提供的DH5α 感受态细胞。北京索莱宝科技有限公司提供的LB固体培养基(干粉)。

2)仪器选择如下。①青岛海尔科技有限公司提供的DTY-1360型洁净工作台。②北京六一仪器厂提供的DYY-7C电泳仪。③顺德市美的微波炉制造公司提供的微波炉。④青岛海尔电冰柜有限公司提供的冰箱。⑤美国SCILOGEX公司提供的D1008 手掌式离心机。⑥美国Thermo公司提供的Nano Drop ND2000C超微量核酸蛋白仪。⑦RS生物工程有限公司提供的CO2培养箱。⑧金坛市富华仪器有限公司提供的THZ-C恒温振荡器。⑨江苏海门其林贝尔仪器公司提供的GL-802B型微型台式真空泵。

2.3 引物设计

以口蹄疫O/GX/09-7株检测为例,引物由宝生物工程(大连)有限公司合成,引物序列:FMDV-VP1-F:5’-TAAATGTATTGGACCTGATGCAGA-3’[2]。

2.4 检测方法

2.4.1 病料处理

将水泡液样品置于样品保存液中(保存液含有磷酸盐缓冲液0.08 mol/L,磷酸盐缓冲液pH值7.2 ),水泡液样品和保存液共10 mL,按照当前剂量,放入0.002%酚红、0.01%血清白蛋白、100 IU/mL 制霉菌素,50 IU/mL 多粘菌素,1 000 IU/mL青霉素,对样品按照01、02……顺序编号,采集的样品置于-20 ℃冷冻保存备用,获得水泡液样品浸出液之后,提取病毒总的RNA。

2.4.2 标准品RNA制备

在提取病毒总的RNA时,整个操作过程在36～37 ℃室温下进行,操作步骤如下。①将RLT Buffer裂解液加入到离心管(eppendorf,EP)中(下文均用EP管表示),EP管容量为1.5 mL,RLT Buffer裂解液容量为500 μL ,取病毒悬液250 μL,加入750 μL TRlzol® Reagent试剂中振荡,振荡时间约为30 s,36 ℃室温静置5 min。②每1.5 mL离心管中加入200 μL氯仿振荡,振荡时间约为30 s,37 ℃室温静置5 min。③离心后观察到液体分层,第2次转移700 μL液体至吸附柱中,弃收集管中液体。④取上层液相至1.5 mL离心管中(新管),重复摇匀,加入异丙醇(与上层液同体积),置于-20 ℃环境下10 min,之后每管用 l mL 75%冷乙醇洗一次,上清之前置4 ℃环境下离心15 min,室温风干,加入20 μL的无核酸酶水(RNasefree ddH2O)至膜中央,之后加入超纯水(DEPC 处理水),剂量为9.5 μL,将得到的RNA用于反转录或置于-20 ℃保存备用。

2.4.3 DNA 的聚合酶链式扩增

用一步法 RT-PCR 试剂盒进行反转录[3]。以提取的RNA作为模板,反应体系(25 μL)具体如下。①RNA提取液:9.5 μL。②5×MLV Buffer(逆转录酶缓冲液5个):1.0 μL。③MLV (逆反录酶):1.0 μL。④0.1 M DTT(0.1 M DTT还原剂,规格2 mL):1.1 μL。⑤脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs(2.5 mmol):4.0 μL。⑥上游引物(10 μmol/L):0.5 μL。⑦模板RNA:2 μL。⑧下游引物(10 μmol/L):0.5μL。⑨RNA 酶抑制剂(20 U/μL):0.5 μL。反转录引物(20 pmol/μL):1.1 μL。

RT-PCR反应参数为:反转录环境温度45 ℃,变性温度95 ℃,延伸温度72 ℃,退火温度58 ℃,预变性温度95 ℃,终延伸温度72 ℃,反应时间依次设定为10 min、30 s、30 s、20 s、10 min、10 min。

2.4.4 回收纯化

将上述PCR产物进行电泳检测,利用DNA纯化试剂盒回收纯化,将切下的琼脂糖凝胶置于EP管中[4]。在1.5 mLEP管中加入 Binding Buffer缓冲液,添加量为1 mL,置于55～65 ℃水浴中温浴,把DNA和凝胶的混合物完全融化,上下颠倒轻微混匀1次,且每隔3 min进行1次,之后将混合溶液转移到电泳缓冲液(HiBind DNA) 柱子,室温下弃去收集管内液体,10 000 g离心1 min,把柱子装入2 mL收集管内,加300 μL Binding Buffer,10 000 g离心1 min,加入700 μL SPW Wash buffer,10 000 g离心1 min,将柱子重新套回收集管中,重复加入700 μL SPW Wash buffer,10 000 g离心1 min,把柱子装在一个1.5 mL离心管上,室温静置2～3 min,-20 ℃保存备用,以此得到纯化胶回收产物。

2.4.5 感受态细胞制备

从-80 ℃冰箱中取出DH5α 感受态细胞,热应激90 s,应激温度为42 ℃,之后再冰浴5 min,向离心管中加入800 μLB 液体,37 ℃(提前预热至37 ℃)振荡,培养45 min,转速约为125～130 r/min。之后弃去大部分上清,置于12 000 r/min环境下离心30 s,用移液枪重悬细菌沉淀,余下约80 μL菌体,匀涂布于含氨苄青霉素的LB(Luria-Bertani) 固体培养基,含量约为20 μg/mL,先正面放置培养约5 min,37 ℃生化培养箱培养12～16 h。之后挑取可疑菌落,37 ℃振荡培养4～6 h。

2.4.6 阳性菌液保存

参照OMEGA公司质粒提取试剂盒中使用方法进行质粒抽提,部分菌液加入灭菌甘油(终浓度为 25%)[5]。向细菌沉淀加入酶溶液(SolutionⅠ),250 μL,获取沉淀,室温静置2 min,彻底重悬之后加入SolutionⅢ(主要成分为醋酸钾),350 μL),有白色絮状沉淀产生后离心,离心时间为10 min,转速为12 000 r/min,将吸附柱置于收集管上,用移液枪小心吸取上清,室温12 000 r/min离心1 min,接着加入缓冲血红蛋白(Buffer HB),500 μL,按照相同离心方式,离心后倾去液体,重复步骤2次,之后得到新的1.5 mL离心管(离心空管1 min,转速为12 000 r/min),加入50 μL灭菌双蒸水,离心1 min,转速控制在12 000 r/min,室温下静置1 min,洗脱收集质粒DNA。基线以仪器(试剂)默认值为参考,阳性对照样品Ct值不大于30,有对数扩增曲线,二者均成立则判定为阳性。

3 试验结果

经过以上检测,得出本次口蹄疫阳性病例检测结果,可以发现300份检测样本中,猪阳性率病例数为2例,阳性病例占比为1.92%(2/104),牛羊阳性率较低,各为1例,阳性病例占比分别为0.98%(1/102)、1.06%(1/94),总检出率1.33%(4/300);如果按照畜种日龄和性质划分,300份检测样本中,育肥畜中阳性病例数量最多(2例),阳性病例在同群体占比1.42%,在总样本中占比0.67%,其次是种公畜和仔畜(均为1例),种公畜阳性病例在同群体占比4.17%,在总样本中占比.33%,仔畜阳性病例在同群体占比1.05,在总样本中占比0.33%。具体情况如表1所示。

表1 口蹄疫阳性病例分布情况

4 结束语

文章主要以4家养殖场不同猪、牛、羊群血清样本共300 份为例,对300头猪牛羊的水疱液样品进行检测,在生物试剂与仪器、引物设计、标准品 RNA 制备、DNA 聚合酶链式扩增、感受态细胞制备、阳性菌液保存等方面,给出口蹄疫病毒检测方法,可得出本次试验中阳性病例确诊情况。相关部门和技术人员应根据本次口蹄疫检测结果,在确诊后第一时间做出消毒、扑杀、净化等一系列处理工作,以此避免疫情的大规模爆发和蔓延。