膝痹康颗粒中挥发油和有效成分的提取工艺研究

李 红,王 芳

唐山市中医医院药学部,唐山 063000

膝痹康方剂来源于孙思邈的《千金翼方》中的苍梧道士陈元膏,也被收录于《千金要方》卷七,该方剂主要由当归、细辛、川芎、桂心、天雄、生地黄和白芷等中药材组成,主治风湿骨疼,具有活血化瘀、舒筋通络、祛风湿、止痹痛等多重功效。方剂中以当归和生地黄为君药,以天雄、干姜、细辛、白芷为臣药,具有活血化瘀、祛风除湿、散寒止痛之功效。膝痹康被广泛应用于膝关节骨性关节炎(osteoarthritis of the knee, KOA)的临床治疗[1],有临床研究表明[2-3],膝痹康不仅能缓解KOA患者静息时的疼痛,还能减轻关节压痛和行走疼痛,并恢复膝关节活动度,缓解关节僵硬。研究人员进行了动物实验,从组织学、组织形态学以及细胞学均证实膝痹康能减轻KOA关节中的炎症反应,减轻关节水肿、延缓关节炎的病情进展[4-5]。传统的制备方法较为复杂,不利于药物的推广和患者的使用,在继承传统制药方法的基础上,依据现代工艺进行进一步提取优化,将膝痹康方剂开发制成成方颗粒制剂,有助于该药物的临床应用。本研究以膝痹康方剂为参比,对膝痹康颗粒的提取工艺进行优化,为中医经典名方的开发提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪;色谱柱为Kromasil C18(200 mm×4.6 mm,5 μm)、Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);十万分之一电子天平(梅特勒公司);FRQ-1002T超声波处理器(法兰特);岛津UV-265 型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)。

1.2 试药

对照品:无水葡萄糖(成都艾博克生物科技有限公司);地黄苷D(质量分数≥99.3%)、益母草苷(质量分数≥99.0%)、Z-藁本内酯(质量分数≥99.5%)和毛蕊花糖苷(质量分数≥99.5%)均购自成都普菲德生物有限公司;阿魏酸(质量分数≥99.8%,Sigma公司)。甲醇、乙腈为色谱纯,均购自默克公司;磷酸(分析纯,天津永大化工有限公司);水为超纯水;其他试剂均为分析纯。

当归(批号211201)、细辛(批号200813)、川芎(批号201112)、桂心(批号211015)、天雄(批号200806)、生地黄(批号210905)、白芷(批号210506)等饮片均购自嘉兴东方国药饮片有限公司,饮片经唐山市中医医院赵卫主任医师鉴定,均符合2020年版《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)中的相关规定。

2 方法与结果

2.1 标准膝痹康方剂的制备

膝痹康方剂的中药处方:当归50 g,细辛50 g,桂心50 g,天雄30枚,生地黄1 500 g,白芷75 g,川芎50 g,丹砂100 g,干姜125 g,乌头150 g,松脂400 g。将诸药粉碎成细末,在体积分数为75%的乙醇中浸泡24 h,将沉渣过滤,将提取液倒入锅中加热,加热浓缩至稠浸膏(含水量约为40%～60%),并加入凡士林,待凡士林融化后停止加热,待冷却后,即得。

2.2 标准膝痹康方剂成分检测

2.2.1挥发油提取率检测 提取方法参考2020年版《中国药典》。取上述药材,置于圆底烧瓶中,加入适量蒸馏水,室温浸泡2 h,加热至沸腾并保持微沸5 h,读取挥发油测定器中挥发油的量。

2.2.2糖苷检测 检测地黄苷D、益母草苷和毛蕊花糖苷3种苷类的含量。色谱条件:Kromasil100-5 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相乙腈(A)-水(B)梯度洗脱(0～15 min,3%～8% A; 15.01～30 min,20%～28% A),检测波长为203 nm,柱温为30 ℃,进样量为10 μL,理论塔板数不低于5 000,与相邻组分峰的分离度均大于1.5。

对照品溶液的制备:用甲醇制成每1 mL 含地黄苷D、益母草苷和毛蕊花糖苷100 μg的对照品溶液。

供试品溶液的制备:挥发油提取结束后,减压蒸馏定容至50 mL,再取2 mL挥发晾干,用甲醇溶解并定容至10 mL,用0.22 μm滤膜过滤。

精密吸取上述对照品溶液稀释至不同质量浓度,以色谱峰面积对对照品质量浓度进行线性回归。结果显示,地黄苷D对照品在3.0～335.0 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系,回归方程为y1=995.7x1+24.27,R2=0.999。益母草苷对照品在7.3～200.0 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系,回归方程为y2=85.09x2- 6.962,R2=0.998。毛蕊花糖苷对照品在5.5～188.0 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系,回归方程为y3=101.6x3-46.88,R2=0.998。

精密度实验:精密吸取上述同一供试品溶液并连续进样6次,地黄苷D、益母草苷和毛蕊花糖苷峰面积测定值的RSD值分别为1.15%、1.23%、1.16%,表明精密度良好。

重复性实验:从同一方剂中取6份药材,并制备供试品溶液,进样检测,地黄苷D、益母草苷和毛蕊花糖苷的RSD值分别为2.21%、1.44%、1.56%,表明重复性良好。

回收率实验:从同一方剂中取6份药材,并制备供试品溶液,精密量取并加入对照品,计算回收率,地黄苷D、益母草苷和毛蕊花糖苷的平均加样回收率分别为99.17%、97.97%、104.87%,RSD值分别为3.46%、4.04%、1.83%。

根据回归方程计算标准膝痹康方剂中地黄苷D、益母草苷和毛蕊花糖苷的含量,结果见图1、表1。

表1 标准膝痹康方剂各成分测定结果

注:A.对照品;B.供试品;1.地黄苷D;2.益母草苷;3.毛蕊花糖苷。

2.2.3总多糖检测 配制质量浓度为300 μg·mL-1的葡萄糖对照品溶液,分别稀释至不同质量浓度。每管加入1 mL 50 mL·L-1苯酚溶液(临用现配),加入5 mL浓硫酸,摇匀,在490 nm处测定吸光度值,得回归方程y4=1.1x4+0.126,R2=0.999。精密量取供试品溶液1 mL,在上述条件下测定吸光度值,并根据回归方程计算总多糖的含量,结果见表1。

2.2.4阿魏酸、Z-藁本内酯检测 色谱条件:色谱柱为Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm ,5 μm)。流动相B为乙腈,流动相A为1 mL·L-1磷酸水溶液,0～15 min,5%～35% B;15～30 min,35%～70% B;30～40 min,70%～95% B。流速为1 mL·min-1;柱温为30 ℃;进样量为10 μL;检测波长为325 nm。理论塔板数均大于5 000,与相邻组分峰的分离度均大于1.5,结果见图2。

注:A.对照品;B.供试品;1.阿魏酸;2.Z-藁本内酯。

对照品溶液的制备:用甲醇溶解制成每1 mL含100 μg阿魏酸、1 mgZ-藁本内酯的对照品溶液。

供试品溶液的制备:精密量取膝痹康标准方剂汤液10 mL,蒸干后将其转移至量瓶中,加入50 mL体积分数为70%的乙醇,混匀后离心,吸取上清液2 mL,用0.45 μm微孔滤膜滤过,并用甲醇稀释至10 mL。

精密吸取上述对照品溶液,稀释至不同质量浓度,以色谱峰面积为纵坐标、对照品质量浓度为横坐标,进行线性回归。结果显示,阿魏酸对照品在4.8～168.8 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系,回归方程为y5=102.1x5+88.23,R2=0.999;Z-藁本内酯对照品在2.2～155.2 mg·mL-1范围内呈良好的线性关系,回归方程为y6=101.4x6+1.265,R2=0.999。

精密度实验:精密吸取上述同一供试品溶液并连续进样6次,阿魏酸、Z-藁本内酯峰面积测定值的RSD值分别为1.88%、2.26%,表明精密度良好。

重复性实验:从同一方剂中取6份药材,并制备供试品溶液,进样检测,阿魏酸、Z-藁本内酯的RSD值分别为3.44%、1.72%,表明重复性良好。

回收率实验:从同一方剂中取6份药材,并制备供试品溶液,精密量取并加入对照品,计算回收率,阿魏酸、Z-藁本内酯的平均加样回收率分别为101.36%、97.75%,RSD值分别为 1.94%、1.72%。

根据回归方程计算供试品溶液中阿魏酸、Z-藁本内酯的含量,结果见图2、表1。

2.2.5浸膏得率计算 精密吸取标准汤液10 mL,分别置于已干燥至恒质量的蒸发皿,蒸干,于105 ℃烘3 h,取出,置于玻璃干燥器中冷却后称质量,计算浸膏得率,结果见表1。

2.3 提取工艺优化

2.3.1挥发油提取 取方剂中富含挥发油的药材(包括当归、细辛、白芷、干姜)进行挥发油提取,提取方法参考2020年版《中国药典》:取上述药材,置于圆底烧瓶中,加入适量蒸馏水,室温浸泡2 h,加热至沸腾并保持微沸5 h,读取挥发油测定器中挥发油的得量。

按处方比例,取当归50 g、细辛50 g、白芷75 g、干姜25 g混匀,拟定A加水量(8、10、12倍)、B浸泡时间(30、60、90 min)、C提取时间(3、6、9 h)3个影响因素。根据L9(34)正交表进行挥发油提取实验。挥发油提取率(%)=[挥发油量(mL)/原材料的量(g)]×100%。正交实验结果和方差分析结果表明,C因素(提取时间)为影响挥发油提取的显著因素(P<0.05),A和B因素均为非显著因素(P>0.05),因此将A1B1C3作为最佳提取条件,即8倍水浸泡30 min、提取9 h。称取3份药材,按上述最佳条件进行工艺验证,挥发油的得量分别为1.12、1.15、1.14 mL,RSD值为1.34%,表明该工艺较为稳定。挥发油提取工艺正交实验见表2。

表2 挥发油提取工艺正交实验结果

2.3.2活性成分提取 先按照最佳工艺条件将处方饮片中的挥发油提出,再将药渣晾干与处方中剩余饮片合并,拟定A乙醇体积分数(50%、70%、90%)、B溶剂倍数(5、7、9倍)、C提取时间(1、2、3 h)3个影响因素,根据L9(34)正交表进行工艺优化回流提取实验,微沸提取,提取结束后减压蒸馏、浓缩并定容至50 mL量瓶中,再精密吸取2 mL此浓缩提取液置于蒸发皿中,挥发晾干,再次加入2 mL甲醇溶解并定容至10 mL,摇匀后用0.22 μm滤膜过滤。然后分别用2.2项下方法检测地黄苷D 、益母草苷、毛蕊花糖苷、总多糖、阿魏酸、Z-藁本内酯的含量并计算浸膏得率(%)。

正交实验结果见表3,方差分析结果见表4。由表3、表4可知,乙醇体积分数、溶剂倍数和提取时间均为影响结果的主要因素(P<0.05),随着乙醇体积分数、溶剂倍数和提取时间的增加,提取得到的各种活性物质的含量均呈增加的趋势,但是K2-K1>K3-K2,表明水平2与水平3之间各指标的结果相差较小,乙醇体积分数、溶剂倍数和提取时间均选择水平2,确定的条件为A2B2C2,即加入7倍体积分数为70%的乙醇提取2 h。称取3份药材,按上述最佳条件进行工艺验证,提取得到的地黄苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷、总多糖、阿魏酸、Z-藁本内酯的含量及浸膏得率均较为稳定,表明该工艺较为稳定,见表5。

表3 活性成分提取工艺正交实验结果

表4 方差分析结果

表5 验证实验结果

2.4 提取工艺确定

取当归、细辛、白芷、干姜混匀,加入8倍水浸泡30 min、提取9 h,挥发油提取结束后,将药渣晾干与处方中剩余饮片合并,加入7倍体积分数为70%的乙醇,回流提取2 h,减压蒸馏、浓缩,冻干。

3 讨论

以标准汤剂为参比开展对经典中药方剂工艺的研发是当今中医药研究的趋势,综合比较各种有效成分指标是评估现代工艺常用的重要手段之一。本研究根据古方典籍《千金翼方》中的记载,测定膝痹康方剂的主要有效成分,并与优化提取工艺进行对比研究。挥发油是中药配方特别是外用膏剂配方中的重要有效成分,挥发油中含有多种芳香物质,是外用膏剂通过皮肤给药的主要有效成分,挥发油的含量是评价其质量的重要指标之一[6-8]。现代药理研究表明[9-10],当归、白芷、细辛和干姜均富含挥发油,因此本研究在进行活性成分提取前,先用水提法对方剂中的挥发油进行提取。参照《中国药典》,水提法是提取挥发油的主要方法,提取时间是影响挥发油得率的最主要因素[11],本研究确定挥发油最佳的提取条件是加入8倍量水浸泡30 min、提取9 h。

张海鸣等[12]报道橘红挥发油最佳提取工艺条件为10倍量水、浸泡30 min、提取8 h。肖宇等[13]报道生姜艾叶洗剂挥发油最佳提取工艺条件为4倍量水、浸泡30 min、提取2次、每次3.5 h。本研究的工艺用水量、浸泡时间和提取时间可行。除了挥发油以外,当归、生地黄、细辛、川芎、桂心、天雄、白芷等药材中的药效成分主要为苷类、多糖类、有机酸类,地黄苷D、益母草苷和毛蕊花糖苷是地黄中的主要有效成分[14-16],阿魏酸是主要的有机酸成分[17],Z-藁本内酯[18-19]是当归中的有效化学成分,浸膏得率可反映处方提取物的量[20],因此本研究选用上述指标对提取工艺进行评价。

目前关于膝痹康颗粒现代提取工艺的研究非常少,本研究采用正交实验法分别对挥发油及活性成分的提取工艺进行优化。水提法是挥发油的标准提取方法,经过正交实验,发现只有提取时间为影响挥发油提取量的关键因素,确定最佳的挥发油提取条件为8倍水、浸泡30 min、提取9 h。在提取完挥发油后,再用乙醇回流提取法对有效成分的提取进行优化,乙醇是苷类、有机酸、多糖类的有效溶剂,通过正交实验确定最佳提取条件为加入7倍体积分数为70%的乙醇提取2 h,并进行验证实验,结果发现与标准方剂比较,优化工艺的挥发油、地黄苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷、总多糖、阿魏酸、Z-藁本内酯和浸膏得率均更高,且工艺稳定,可获得稳定的挥发油和冻干粉末颗粒。