迷迭香水提物对白鲢肉脱腥活性物质研究

马晨阳,黄丕苗,段萍,王璐,冯西娅,阚建全*

1(西南大学 食品科学学院,重庆,400715)2(中匈食品科学联合研究中心,重庆,400715) 3(农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(重庆),重庆,400715) 4(川渝共建特色食品重庆市重点实验室(重庆),重庆,400715)

白鲢(Hypophthalmichthysmolitrix),隶属于鲤形目,鲤科,鳅亚科,鲢属,为我国四大淡水鱼之一。白鲢富含优质蛋白、不饱和脂肪酸和微量元素,同时具有价格低廉、抗病性强、生长迅速等优点,深受食品企业和消费者的欢迎,对于丰富人类膳食结构具有重要作用[1]。但白鲢肉中普遍存在腥味较重的缺点,严重降低了白鲢肉的食用品质和商业接受度。腥味产生的原因主要有3个,分别是环境因素、脂肪氧化以及微生物作用。首先是淡水鱼在生长过程中会吸附环境中的异味物质;其次是不饱和脂肪酸在微生物和内源酶的作用下氧化所产生的醛酮类物质和三甲胺(trimethylamine,TMA)[2]。目前,脱除腥味的方法主要有物理法、化学法和生物法。物理脱腥法存在较大的应用限制,且效果较差。生物脱腥不仅会产生其他异味,并且会对鱼产品理化性质造成影响。化学脱腥中化学物质的残留以及可能产生其他有害物质会引起公众担忧[3]。因此,急需寻找一种绿色天然的脱腥剂替代品。

迷迭香(Rosmarinusofficinalis)是一种产自地中海地区的芳香植物,除具有抗动脉粥样硬化、抗抑郁、抗炎和抗菌活性外,还被广泛用作烹饪香料,并且能显著提高食品的感官特性[4]。黄丕苗等[5]研究发现,迷迭香提取物能显著降低白鲢肉的腥味物质含量和提高其感官品质。MARTNEZ-ZAMORA等[4]发现使用迷迭香提取物处理后可以有效地降低鱼饼的TMA含量和改善鱼肉饼的风味。目前使用天然植物提取物浸泡脱腥已被广泛使用,虽然天然植物提取物中多酚、蛋白质和多糖与挥发性物质之间具有相互作用,并影响挥发性化合物浓度[6],但对于天然植物提取物中哪些组分具有脱腥效果尚不明确。

因此,本文以白鲢为研究对象,拟采用分别脱除多酚、多糖和蛋白质后的迷迭香水提取物(Rosmarinusofficinalisaqueous extract,RE)对白鲢肉进行浸泡脱腥试验;以感官腥味值、挥发性成分含量变化作为脱腥效果评价指标,考察具有脱腥作用的组分;采用液相色谱/质谱联用技术对RE中的酚类物质进行定性与定量分析,选择不同浓度酚类单体物质进行脱腥实验。本文旨在探索RE中具有脱腥效果的组分及其主要脱腥活性物质,为进一步明确迷迭香提取物脱腥机理提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

RE,西安圣青生物科技有限公司;白鲢(1.40～1.50 kg),重庆北碚区天生丽街永辉超市。将活鱼处理后,切成2 cm×2 cm×1 cm的方块。

分析纯试剂:无水碳酸钠、苯酚、无水葡糖糖、乙醇、硫酸氢钠,成都市科隆化工试剂厂;福林酚,北京索莱宝科技有公司;没食子酸、交联聚乙烯吡咯烷酮(crosslinked polyvinylpyrrolidone,PVPP)、庚醛、辛醛、1-辛烯-3-醇、E-2-辛烯醛、壬醛和癸醛,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;浓硫酸,川东化工。

色谱纯试剂:2-辛醇、迷迭香酸、甲醇和己醛,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;鼠尾草酸、鼠尾草酚,北京索莱宝科技有限公司;乙腈、甲酸,成都市科隆化工试剂厂。

总蛋白定量测定试剂盒,南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

固相微萃取头(配有50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纤维),美国Supelco公司;Agilent 1260型超高效液相色谱仪,美国Agilent公司;QP 2010 Plus型气相色谱-质谱联用仪,日本岛津公司;DF-101S型集热式恒温磁力搅拌器,河南予华仪器有限公司;SQP电子分析天平,德国赛多利斯科学仪器有限公司;Synergy H1全波长酶标仪,美国伯腾仪器有限公司;5810型台式高速离心机,德国Eppendorf公司;impact Ⅱ型高分辨率质谱仪,德国布鲁克科技有限公司;ALPHA1-4/2-4LSC 型冷冻干燥机,德国CHRIST公司;YF-111B型中药粉碎机,西安市永历制药机械有限公司;YM-080S型超声仪,深圳市方奥微电子有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 RE不同组分对白鲢肉腥味脱除实验

1.3.1.1 RE的提取

参照TAJNER-CZOPEK等[7]的方法并略作修改。将迷迭香置于真空冷冻干燥机中进行冻干,之后使用研磨机将其粉碎。称取迷迭香粉末2 g置于圆底烧瓶中,加入100 mL蒸馏水混合,加入1 g/L的NaHSO3,将混合物进行超声提取,超声提取的条件为:功率220 W,时间15 min,温度25 ℃。超声提取后以5 000 r/min离心10 min,取其上清液置于旋转蒸发仪中进行干燥。收集其干燥物于棕色小瓶中于-20 ℃保存待用。

1.3.1.2 对比试验

称取0.1 g的RE,溶解于超纯水中并定容至100 mL,设为C1组。C1组为未经任何处理的迷迭香水提物原液,然后随机选取预处理后的白鲢肉块,称重,并浸泡在C1溶液中,料液比为1∶3(g∶mL),浸泡时间30 min,然后进行挥发性成分测定和感官评价,此为对比组试验。

1.3.1.3 RE多酚对白鲢肉脱腥效果的影响

分别向未经任何处理的迷迭香水提物原液C1组中加入0.5、1、2 g/L溶胀PVPP[V(PVPP)∶V(超纯水)=1∶10,溶胀60 min以上]脱除多酚。在室温下静置1 h后离心(9 000×g,15 min),取上清液分别得到C2、C3、C4组,进行总酚、总糖和总蛋白测定。随机选取预处理后的白鲢肉块,称重,并浸泡在C2、C3、C4组溶液中,料液比(g∶mL)为1∶3,浸泡时间30 min,然后进行挥发性成分测定和感官评价。

1.3.1.4 RE多糖对白鲢肉脱腥效果的影响

分别向未经任何处理的RE原液C1组中加入400 mL的无水乙醇以脱除多糖,在4 ℃下条件下静置24 h后离心(10 000 ×g,15 min)得到上清液,旋转蒸发去除多余乙醇,再溶解于超纯水和3%(体积分数)乙醇溶液中,定容至100 mL得到C5组,进行总酚、总糖和总蛋白测定。随机选取预处理后的白鲢肉块,称重,并浸泡C5组溶液中,料液比为1∶3(g∶mL),浸泡时间30 min,然后进行挥发性成分测定和感官评价。

1.3.1.5 RE蛋白质对白鲢肉脱腥效果的影响

分别向未经任何处理的RE原液C1组中加入适量的三氯乙酸以脱除蛋白质,调节质量浓度为150 g/L后定容至100 mL。充分混匀后在-20 ℃下静置2 h,离心(10 000×g,15 min)后取上清液得到C6组,进行总酚、总糖和总蛋白测定。随机选取预处理后的白鲢肉块,称重,并浸泡C6组溶液中,料液比为1∶3(g∶mL),浸泡时间30 min,然后进行挥发性成分测定和感官评价。

1.3.2 RE中酚类物质的定性与定量

称取0.1 g的RE,配制成1 mg/mL溶液,过0.22 μm的微孔滤膜后待测。

1.3.3 酚类单体物质对白鲢肉的脱腥效果和脱腥能力评价

随机选取预处理后的白鲢肉块,称重,并分别浸泡在天然浓度(参考2.3节所得酚类物质定量结果)和固定浓度的酚类单体物质溶液中,料液比为1∶3(g∶mL),浸泡时间30 min,进行挥发性成分测定和感官评价。

1.4 分析测定方法[8]

1.4.1 总酚、总糖、总蛋白含量的测定

以没食子酸为对照品,采用福林酚法测定迷迭香水提物样品中总酚含量;采用苯酚硫酸法测定迷迭香水提物中总糖含量;参照市售BCA试剂盒使用方法测定总蛋白含量。

1.4.2 腥味值评定

1.4.2.1 感官评价人员的选择

在西南大学食品科学学院招募志愿者,将TMA稀释为不同质量浓度梯度(10～1 000 mg/L)的供试液,测试受评人员(身体健康,无嗅觉障碍)的腥味敏感度,最终筛选出10名嗅觉灵敏的感官分析人员(5男5女,年龄20～28岁)。对感官评价人员进行定期感官评定训练,使他们熟悉嗅觉语言和嗅觉评价方法,感官评定在感官实验室中进行。

1.4.2.2 感官评价方法

取脱腥前后鱼肉各10 g于20 mL棕色试剂瓶中。在37 ℃培养箱中静置30 min后,感官评价人员对白鲢肉的腥味进行5分制感官评定。以100 mg/L的TMA水溶液为标准参照,定义腥味强度为5分。气味强度进行如下评级:1分,非常微弱;2分,弱;3分,正常;4分,强劲;5分,非常强劲。

1.4.3 脱腥前后白鲢肉中挥发性成分测定

取3 g脱腥前后的白鲢肉置于20 mL螺口顶空样品瓶中,再向瓶内加入100 μg/mL的2-辛醇标准品1 μL作为内标物,最后加入7 mL的250 g/L NaCl溶液及磁转子,密封。将已活化好的DVB/CAR/PDMS萃取头插入顶空瓶当中,在60 ℃下平衡15 min 后开始萃取,相同条件顶空吸附30 min,萃取完成后在GC-MS进样口解吸5 min,进行气质测定。

气相色谱条件:采用DB-5MS毛细管(30 m×0.25 mm,0.25 μm)色谱柱。升温程序:柱初温度40 ℃,保持2 min,先以5 ℃/min升温到150 ℃,1.5 ℃/min升温到165 ℃,再以15 ℃/min升温到210 ℃,最后以10 ℃/min升温到250 ℃,保持5 min,进样口温度250 ℃;载气(氦气)流速为1.2 mL/min。

质谱条件:接口温度280 ℃;电子能量:70 eV;离子源温度:230 ℃;质量扫描范围:30～500m/z。

样品中各挥发性成分的含量Ci(μg/kg)按公式(1)计算:

(1)

式中:ρ为内标物的质量浓度,μg/mL;V为内标物体积,μL;Si为各挥发性组分的峰面积;S为内标物质的峰面积;m为样品的质量,g。

1.4.4 香气活力值(odour active values,OAV)的计算

OAV值计算如公式(2)所示:

(2)

式中:Ci为各挥发性化合物的浓度;OTi为各挥发性化合物在文献中报道的气味阈值。

1.4.5 RE中酚类物质的定性分析

RE中酚类物质的定性参照HUANG等[8]的方法,并略做修改。色谱条件:色谱柱为Eclipse Plus column C18 (3.5 μm, 4.6 mm×100 mm);流动相A为0.1%(体积分数)甲酸水,流动相B为0.1%(体积分数)甲酸乙腈溶液,RE梯度洗脱:0～10 min,12%～25% B;10～18 min,25%～90% B;18～19 min,90%～100% B;19～24 min,100% B,流速为0.2 mL/min;柱温40 ℃;进样量1 μL;进样进样前以初始流动相比例平衡5 min。

质谱条件:采用电喷雾离子源,质谱扫描模式采用负离子扫描模式,毛细管电压为3 000 V,脱溶剂气体(氮气),干燥温度为220 ℃,脱溶剂气体流量为8 L/min,干燥器温度为220 ℃,扫描范围为m/z50～1 300,碰撞气体为氩气。

1.4.6 RE中主要酚类物质的定量分析

RE中主要酚类物质的定量条件为:色谱柱为ZORBAX SB-Aq C18 column(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相A为0.1%甲酸水,流动相B为甲醇,梯度洗脱:0～10 min, 5% B;10～30 min,5%～30% B;30～40 min,30%～50% B;40～50 min,50%～70% B;50～60 min,70%～5% B。流速为1 mL/min;柱温35 ℃;进样量10 μL,使用外标法对酚类物质进行定量。

1.5 数据处理与分析

除特殊说明外,所有试验数据均由3次重复试验以平均值±标准偏差表示。采用SPSS 19.0、Excel、Origin软件对试验数据进行分析和作图,采用Duncan′s进行显著性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 不同处理后的RE中总酚、总糖和总蛋白的含量变化

由图1可知,经过PVPP处理后,RE的总酚含量均显著下降(P<0.05)。这是因为PVPP作为一种多酚吸附剂,通过吸附和疏水相互作用从而吸附多酚。此外,PVPP添加量不同,吸附的多酚含量也有所不同,多酚含量随着PVPP添加量增加而下降。C5和C6相比C1组总酚含量较略有下降但无显著性差异,这可能是因为在脱蛋白和脱多糖的过程中破坏了部分多酚。上述结果说明,除去多酚和蛋白质对迷迭香水提物的总糖含量没有影响。C1组的总蛋白含量为112.67 mg/g,C5组的总蛋白含量C1组降低92.33%。这是因为蛋白质在三氯乙酸的作用下形成了不可逆沉淀,从而达到脱除蛋白的效果。

图1 不同处理后的RE中总酚、总糖和总蛋白的含量变化Fig.1 Changes in the contents of total phenols, total sugars and total proteins in RE under different treatments注:不同小写字母表示表示差异性显著(P<0.05)(下同)

2.2 不同处理后的RE对白鲢肉脱腥效果的比较

2.2.1 不同处理后的RE对白鲢肉挥发性物质的影响

如表1所示,26种挥发性成分在白鲢肉中被检出,包含8种醛类、6种醇类、5种烃类、2种酮类、4种酯类和1种肟类,大多数化合物在白鲢或者其他鱼类(鳕鱼、带鱼和草鱼等)已被报道过[9]。α-蒎烯、芳樟醇和长叶薄荷酮等来源于RE本身的挥发性成分在处理组中被检出。

表1 不同处理后的RE对白鲢肉挥发性物质的影响Table 1 Effects of RE under various treatments on volatile compounds in silver carp

醛类化合物是脂质氧化降解的二级产物,阈值较低,是导致鱼腥味的主要原因。己醛主要由亚油酸和亚麻酸氧化分解产生,对鱼腥味的贡献是所有醛类之中最大,同时在白鲢肉被检测到的所有醛类物质之中含量也是最高的,达到了65.64 μg/kg。挥发性醇类化合物主要由脂肪氧化分解和羰基化合物还原产生,也会导致鱼腥味。在本研究中,醇类物质中1-辛烯-3-醇含量高达81.75 μg/kg。有研究报道,1-辛烯-3-醇由花生四烯酸氧化分解产生,具有蘑菇味和鱼腥味,因其阈值低,也是造成鱼制品具有不愉快气味的原因[10]。烃类、酮类和酯类物质因其阈值高,所以对鱼腥味贡献较小。

与对照组相比,所有RE处理组的挥发性化合物的含量均有所下降。RE处理组中,C1、C5和C6组之间挥发性化合物的含量变化较小,C1、C2、C3和C4组挥发性化合物的含量存在较大差异。C1、C2、C3、C4、C5和C6组的己醛含量较CK组分别下降45.70%、39.41%、29.62%、23.23%、40.93%和39.74%;壬醛含量下降了42.42%、30.87%、23.22%、18.52%、36.27%和37.44%;1-辛烯-3-醇含量下降了40.97%、36.07%、24.91%、13.59%、36.84%和34.26%。这说明不同处理后RE对白鲢肉中腥味物质脱除效果存在差异,脱除多酚组中RE脱腥能力下降,而脱除蛋白和多糖则不影响RE脱腥能力,表明多酚是RE中起到脱腥作用的主要成分。CHEN等[11]也发现波纹巴非蛤酶解液经过茶多酚处理后,波纹巴非蛤酶解液中的醛类物质含量显著下降。RE处理组之间对白鲢肉腥味物质的脱除效果不同可能是因为其多酚含量的差异。

2.2.2 不同处理后的RE对白鲢肉感官评分的影响

由图2可知,RE处理组的腥味值均显著小于对照组(P<0.05),表明白鲢肉的感官品质得到了显著改善。这一结果与MARTNEZ-ZAMORAL等[4]研究结果一致,即RE能显著改善食品的感官品质。此外,不同多酚含量的RE处理组的腥味值存在显著性差异(P<0.05)。RE处理时,C1、C2、C3、C4、C5和C6组的腥味值为对照组的57.37%、66.21%、78.74%、83.68%、55.79%和57.68%。CHOI等[12]的研究也表明,多酚含量会影响植物水提物的除臭能力,多酚含量越高,除臭效果越好。感官评价实验结果与挥发性物质变化实验结果相印证,均表明多酚是RE中起到脱腥作用的主要成分。

图2 不同处理后的RE对白鲢肉腥味值的影响Fig.2 Effect of RE under different treatments on fishy odor value in silver carp

2.2.3 不同多酚含量的RE对白鲢肉中腥味活性物质OAV值的影响

如前所述,实验证明多酚是RE中起到脱腥作用的主要成分,而RE中的蛋白质和多糖对其脱腥效果无显著影响。因此进一步分析多酚含量的差异对白鲢肉中腥味活性物质OAV值的影响。挥发性化合物对食品风味风味的贡献由OAV值确定,将化合物的浓度除以其气味阈值来获得OAV值,当OAV大于或等于1时,该化合物的定义为活性挥发性化合物,对食品的总体风味起到主要贡献。己醛、庚醛、辛醛、壬醛、E-2-辛醛、1-辛烯-3-醇和癸醛等OAV值均大于1,认为是白鲢肉的腥味活性物质。由图3可知,与对照组相比,RE处理组的腥味物质OAV值均有所下降,不同多酚含量的RE对腥味物质OAV值的下降程度存在显著性差异(P<0.05)。该实验结果与POURASHOURI等[13]研究一致,即鱼油腥味的脱除程度取决于迷迭香提取物中的多酚含量。

图3 不同处理后的RE对腥味活性物质OAV值的影响Fig.3 Effect of RE under different treatments on OAV of fishy-odor active compounds

2.3 RE中酚类物质的定性与定量分析

基于2.2节的实验结果,得到RE中起到主要脱腥作用的成分为多酚。因此,对RE中的酚类物质进行定性与定量。结合表2,从RE中检测出4种酚类物质,其中代水溶性酚酸迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)被检测出。MUNEKATA等[14]认为RA是迷迭香提取物中的主要活性物质并具有增强其他化合物的的效果(增强化疗药物的活性)。本研究中RE中RA含量为30.12 mg/g。有文献报道,RA是迷迭香提取物中主要活性物质,可显著改善鱼制品风味,降低其异味物质含量[8]。HUANG等[15]的研究表明RA可以与腥味物质竞争性的结合肌原纤维蛋白(myofibrillar protein,MP)中的疏水位点,并且增强蛋白质与蛋白质之间的相互作用,从而促性腥味物质的释放。因此,选择RA作为RE中的主要活性物质继续探究其对白鲢肉脱腥效果的影响。

表2 RE中的酚类物质组成Table 2 Phenolic compounds composition of RE

2.4 酚类单体化合物对白鲢肉脱腥效果的影响

基于2.3节的实验结果,得到RE中RA的含量,将其定义为天然质量浓度。天然质量浓度的RA对腥味活性物质脱除效果如图4所示,白鲢肉腥味活性物质含量和腥味值均显著下降(P<0.05)。

a-下降率;b-腥味值图4 天然质量浓度的迷迭香酸对白鲢肉脱腥效果的影响Fig.4 Effects of natural concentrations of RA on the deodorizing effect of silver carp

不同质量浓度的RA对腥味活性物质脱除效果如图5所示。由图5可知,RA能有效降低白鲢肉中的腥味活性物质。在质量低浓度下(10 μg/mL),RA对大多数腥味活性物质的脱除效果无显著性差异(P>0.05),随着质量浓度的上升,RA对腥味活性物质的脱除能力逐渐增大。SHI等[17]使用迷迭香提取物涂抹冻藏泥虾能赋予其良好的感官品质,迷迭香提取物的主要活性物质为迷迭香酸。此外,白鲢肉腥味活性物质含量和腥味值下降可能是因为蛋白质与腥味物质之间的相互作用被酚类化合物所影响。白鲢鱼的腥味感知不仅取决于腥味物质的浓度和气味阈值,还取决于腥味化合物与其他食物成分的相互作用,尤其是与蛋白质的相互作用,蛋白质能结合和释放腥味物质从而影响白鲢肉的腥味感知。GENOVESE等[18]研究表明,将橄榄油酚类化合物添加到乳清蛋白中时,观察到挥发性化合物的含量显著增加。综合上述结果,说明RA能有效脱除白鲢肉的腥味,脱腥能力与酚类物质的结构和浓度相关。此外,RA和白鲢肉蛋白质之间的相互作用可能会影响白鲢肉的腥味感知,值得在后续研究进一步探究。

a-下降率;b-腥味值图5 不同质量浓度的迷迭香酸对白鲢肉脱腥效果的影响Fig.5 Effects of different concentrations of RA on the deodorizing effect of silver carp

3 结论

(1)挥发性成分含量变化和感官评价结果表明,迷迭香中主要脱腥组分为多酚且脱腥效果与多酚含量呈正相关。(2)己醛、庚醛、辛醛、壬醛、E-2-辛醛、1-辛烯-3-醇和癸醛的OAV值大于1,是白鲢肉的腥味活性物质。(3)腥味活性物质含量变化和感官评价结果表明,RA为主要脱腥活性物质,在低浓度下,RA对大多数腥味活性物质的脱除效果无显著性差异(P>0.05),但随着质量浓度的上升,RA对腥味活性物质的脱除能力逐渐增强。本文说明了RE中具有脱腥效果的组分为多酚类物质,其脱腥活性物质为RA,对进一步明确RE的脱腥机理提供理论基础。