高效液相色谱法同时检测彩妆类化妆品中8 种着色剂

杜文亚，张晓东

（内蒙古自治区药品检验研究院，内蒙古 呼和浩特 010010）

化妆品中使用的染料多为偶氮类染料或以苯、蒽等为原料，其安全性受到关注。《化妆品安全技术规范（2015 年版）》（简称《规范》）虽明确提供了禁/ 准用着色剂目录，但准用着色剂目录中，多数着色剂无限量要求或仅原料或杂质有限量要求。化妆品中着色剂的检测多采用高效液相色谱（HPLC）法［1-7］、高效液相色谱串联质谱法［8-12］等。根据国家药品监督管理局发布的《化妆品禁用原料目录》［13］，苯胺黄、溶剂黄3、直接棕95、碱性红2 均为禁用着色剂；根据《规范》，碱性蓝26、酸性紫9、酸性橙11、食品红14 均为准用着色剂，但均无限量要求，且仅酸性橙11 和食品红14 在其他限制和要求项下规定了原料或杂质质量要求。本研究中参考《规范》，并结合8 种着色剂的色谱行为分为2 组，第1 组包括碱性红2、酸性紫9、溶剂黄3、苯胺黄、碱性蓝26，第2 组包括酸性橙11、直接棕95、食品红14，采用HPLC 法检测彩妆类化妆品中8 种着色剂，旨在为彩妆类化妆品的质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；XS 105型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；IKAMS3 型涡旋混合器（德国IKA 公司）；3-18KS 型台式高速离心机（德国Sigma 公司）；KS - 500E 型超声波清洗机（昆山洁力美超声仪器有限公司）。

1.2 试药

40批市售彩妆类化妆品样品（眼影或腮红18批、口红22 批），均购自内蒙古自治区；鲜果植物苹果润唇膏空白样品（蜡基质类，基质中含合成蜡、地蜡或微晶蜡，韩国自然乐园化妆品株式会社有限公司，批号为2RLY0805）；Dior单色眼影空白样品（粉基质类，基质中含滑石粉或玉米粉，克丽丝汀迪奥商业< 上海> 有限公司，批号为1D03）；苯胺黄对照品（批号为20227）、溶剂黄3 对照品（批号为20251）、直接棕95 对照品（批号为22346）、碱性蓝26 对照品（批号为26489）、酸性紫9对照品（批号为20105）、酸性橙11 对照品（批号为21772），食品红14 对照品（批号为22583）、碱性红2 对照品（批号为20498），均购自北京曼哈格生物科技有限公司，含量均大于90.0%；磷酸为优级纯，甲醇、乙醇、四氢呋喃均为色谱纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Welch AQ-C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：0.1%磷酸水溶液（A）-甲醇（B）；流速：1.0 mL/min；二极管阵列检测器检测；目标成分的梯度洗脱程序，第1 组为，0 ~ 25 min 时40%B →90%B，25 ~ 26 min 时90%B →40%B，26 ~ 35 min 时40%B，检测波长分别为380 nm（苯胺黄、溶剂黄3）、530 nm（碱性红2、酸性紫9）、600 nm（碱性蓝26），第2 组为，0 ~ 10 min 时73%B →83%B，10~25 min时83%B →73%B，25~35 min时73%B，检测波长分别为230 nm（酸性橙11和直接棕95）、540 nm（食品红14）；柱温：25 ℃；进样量：5µL。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：取8 种对照品各10 mg，精密称定，分别置10 mL 容量瓶中。酸性紫9、溶剂黄3 分别加乙醇、甲醇-水-四氢呋喃（1∶1∶1，V/V/V）溶解并定容，其余6 种均用甲醇- 水（1∶1，V/V）溶解并定容，摇匀，制成质量浓度均为1 mg/mL 的单一对照品贮备液；各精密吸取1.0 mL，按上述分组分别置10 mL 容量瓶中，加甲醇-水（1∶1，V/V）稀释并定容，摇匀，制成各成分质量浓度均为100 µg/ mL 的混合对照品溶液Ⅰ和Ⅱ。

供试品溶液：1）粉基质类供试品溶液。取样品0.2 g，精密称定，置10 mL 离心管中，加甲醇-水-四氢呋喃（1∶1∶2，V/V/V）溶解并定容，涡旋1 min，充分混匀，超声（功率120 W、频率40 kHz，下同）提取20 min，10 000 r/min离心10 min，经0.45µm 微孔滤膜滤过，即得。2）蜡基质类供试品溶液。取样品0.2 g，精密称定，置10 mL 离心管中，水浴（80 ℃）加热至样品融化，加甲醇-水-四氢呋喃（1∶1∶2，V/V/V）溶解并定容，涡旋1 min，充分混匀，50 ℃超声提取20 min，10 000 r/min 离心10 min，经0.45µm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：分别精密吸取混合对照品溶液Ⅰ和Ⅱ适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果各待测组分分离度均大于1.5，峰形佳，理论板数按待测成分峰计均大于18 000。详见图1。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密吸取上述混合对照品溶液Ⅰ和Ⅱ各适量，分别加甲醇-水（1∶1，V/V）稀释、定容、摇匀，分别制备系列混合对照品溶液。取适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分的质量浓度（X，mg/ L）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表1。

表1 线性关系及检测限与定量限考察结果Tab.1 Results of the linear relation test，limit of detection and limit of quantitation

检测限与定量限考察：取2 种不同基质的空白样品适量，分别加入混合对照品溶液Ⅰ和Ⅱ各0.01 mL，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以信噪比（S/N）为3 和10时的待测成分质量浓度分别记作检测限和定量限。详见表1。

精密度试验：精密量取2.2 项下混合对照品溶液Ⅰ和Ⅱ各适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果碱性红2、酸性紫9、溶剂黄3、苯胺黄、碱性蓝26、酸性橙11、直接棕95、食品红14 峰面积的RSD分别为0.43%，0.31%，0.40%，0.42%，0.19%，0.20%，0.12%，0.09%（n= 6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2 项下混合对照品溶液Ⅰ和Ⅱ各适量，分别于室温下放置0 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、7 d 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果直接棕95 和食品红14 在3 d 内稳定，之后逐渐降解；其余6 种着色剂在7 d 内均稳定，RSD均小于2.0%（n=7）。

提取回收试验：取2 种不同基质的空白样品各约0.2 g，精密称定，各9 份，分别置10 mL 离心管内，分别精密加入2.2 项下2 种混合对照品溶液0.04，0.2，0.4 mL，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算平均提取回收率。结果见表2。

表2 提取回收试验结果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.4 样品含量测定

取40 批样品各0.2 g，平行2 份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果仅1批眼影样品（批号为ES 1326K）检出酸性紫9，含量为81.28 mg/kg，其余样品中均未检测出前述8种着色剂。

3 讨论

3.1 色谱条件优化

流动相：分别采用了水-甲醇、水-乙腈、0.1%磷酸水溶液- 甲醇、0.1%磷酸水溶液- 乙腈、乙酸铵溶液（25 mmol/L）-甲醇、乙酸铵溶液（25 mmol/L）-乙腈、0.5%磷酸水溶液-甲醇、0.5%磷酸水溶液-乙腈为流动相。结果采用0.1%磷酸水溶液-甲醇进行梯度洗脱时，各目标组分均响应较高、峰形佳，且与基线分离良好。这是因为甲醇可兼顾不同极性化合物的洗脱，0.1%磷酸水溶液可提高响应，方便各成分的定性和定量检测。但该体系同时检测8 种着色剂时，直接棕95和食品红14 对流动相比例改变较敏感，流动相比例的微小变化导致其保留时间较大变化，易与其他组分交叠并同时出峰；且酸性橙11 与碱性红2 因保留时间接近很难较好地分离。故最终将8 种组分分为2 组，通过调节流动相A、B 的比例，获得最佳的保留效果和分离效果。

色谱柱：预试验中考察了4 种不同品牌的C18柱［Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（柱1）、TechMate C18- ST 柱（柱2）、OMNI Bond Hubble C18柱（柱3）、Welch AQ - C18柱（柱4），规格均为250 mm × 4.6 mm，5 µm］。结果8 种着色剂在柱1 和柱2 上均不能同时达到较好的保留效果，碱性蓝26 在柱1 上受杂峰干扰严重，食品红14在柱1上响应低、峰形欠佳；溶剂黄3在柱2 上无保留行为。待测成分在柱3 和柱4 上均有较好的响应及分离效果，但柱4 的耐酸性更好，结合流动相综合考虑，最终选择柱4。

柱温：预试验中同时考察了不同柱温（15，25，35，45 ℃）对8 种着色剂色谱保留行为的影响。结果柱温为25 ℃时，各组分的分离度最佳。

检测波长：采用二极管阵列检测器对8种对照品溶液进行了全波长扫描。结果第1 组检测波长以380 nm（苯胺黄和溶剂黄3）、530 nm（碱性红2和酸性紫9）、600 nm（碱性蓝26），第2组以230 nm（酸性橙11和直接棕95）、540 nm（食品红14）为佳。

3.2 样品前处理条件优化

提取溶剂：参考文献［1，3-7］及8种着色剂在不同溶剂中的溶解情况，选取甲醇、四氢呋喃、甲醇-水（1∶1，V/V）、甲醇-0.5 mol/L 乙酸铵溶液-四氢呋喃（1∶1∶1，V/V/V）、甲醇-水-四氢呋喃（1∶1∶1，V/V/V）为提取溶剂，考察对空白加标样品中目标成分回收率的影响。结果选取甲醇-0.5 mol/L 乙酸铵溶液-四氢呋喃时，食品红14 峰分解为2 个相邻峰；选择甲醇和甲醇-水（1∶1，V/V）时，基质效应干扰严重，各成分峰形较差且回收率较低；四氢呋喃可明显改善回收率较低的问题，但基质效应仍存在；甲醇- 水- 四氢呋喃，基质效应明显改善，且提取较完全，回收率较高，峰形满足要求。进一步考察该体系中甲醇、水、四氢呋喃不同体积比（1∶1∶1、1∶1∶2、1∶1∶5）对回收率的影响。结果选取甲醇- 水- 四氢呋喃（1∶1∶1，V/V/V）时，多数目标成分回收率良好（80.56%～110.12%）；且随着四氢呋喃比例的增加，食品红14、直接棕95、溶剂黄3 和酸性橙11 的回收率均提高。当甲醇-水-四氢呋喃的体积比为1∶1∶2 时，目标成分的回收效果均达到最佳（86.83%～108.65%）；当四氢呋喃比例再增加时，各成分回收率变化不明显，故最终选取甲醇- 水- 四氢呋喃（1∶1∶2，V/V/V）为提取溶剂。

提取条件：蜡基质类化妆品若直接加入优化的提取溶剂，样品不能充分分散溶解，故需将样品置离心管中水浴（80 ℃）加热至融化。样品仅靠与提取溶剂涡旋振荡不能保证提取完全，故还需考察超声的温度和时间。本研究结果显示，在25 ℃和35 ℃下超声，蜡基质类样品会凝固，不利于提取完全；50 ℃时，样品基质保持良好的分散性和流动性，从而能与提取溶剂充分且有效地接触。粉基质类样品不受超声温度的影响。设置不同超声时间时对2 种空白基质加标样品回收率的影响均不明显，故选择最短的20 min。本研究中同时考察了同为0.45µm 厚的尼龙滤膜和聚四氟乙烯滤膜。结果2种空白基质样品的回收率均较好。

3.3 方法评价

本研究中建立的HPLC 法操作简单，结果准确可靠，可用于同时检测彩妆类化妆品中8 种着色剂。但化妆品配方复杂，膏剂和霜剂采用该方法仍无法实现有效分离及精确定性、定量，且仅以保留时间为定性指标，可能存在假阳性和假阴性情况，故后续需建立高效液相色谱串联质谱法进一步分析，为我国彩妆类化妆品中着色剂的监管和产品质量控制提供参考。