鼻息肉组织黏蛋白5AC、免疫球蛋白E、白细胞介素-35表达对鼻黏膜上皮细胞凋亡的影响

黄辉 蒋劲松 周明朗 代国胜 冀庆军 何苗 柴伟 孙敬武

(1亳州市人民医院耳鼻咽喉头颈外科,安徽 亳州 236800;2中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院))

鼻息肉是耳鼻喉科常见疾病,但目前鼻息肉发病原因及机制尚未完全清楚。随着鼻内镜及各种医疗科技的不断进步,治疗已不再是难以实现的目标,可是仍有部分患者治疗后复发。研究表明,鼻息肉的进展与许多细胞因子有关〔1,2〕。也有研究发现多种慢性炎症参与鼻息肉发病〔3〕。白细胞介素(IL)-35是一种多源性细胞因子,在炎症反应中激活血管内皮细胞及白细胞。黏蛋白(MUC)5AC是腺体细胞产生,在呼吸系统中分泌。免疫球蛋白(Ig)E由呼吸道及胃黏膜等层浆细胞产生。目前这三类呼吸道相关因子与鼻息肉发生关系的临床研究较少。本文探讨RNA干扰技术沉默MUC5AC、IgE、IL-35基因对鼻黏膜上皮细胞凋亡的影响及机制。

1 材料与方法

1.1一般材料 收集亳州市人民医院2019年6月至2020年7月手术切除后存档的慢性鼻窦炎鼻息肉组织石蜡包埋标本40例,其中男27例,女13例,年龄31～71岁,平均(52.33±10.41)岁。纳入标准:(1)首次鼻息肉摘除术者;(2)术前2 d未使用激素药物治疗;(3)签署知情同意书。排除标准:(1)精神异常者;(2)鼻内真菌感染者;(3)支气管哮喘者;(4)严重系统疾病者。选择正常下鼻甲组织对照组,其中男16例,女12例,年龄35～72岁,平均(51.04±10.37)岁。两组一般资料差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究通过医院伦理委员会批准,符合道德伦理要求。

1.2材料和仪器 胰蛋白酶购自杭州昕诚生物科技有限公司;细胞培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)购自广州捷威斯生物科技有限公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自信裕生物(上海)公司;MUC5AC、IgE、IL-35、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3单克隆抗体的二抗均购于美国Abcam;细胞凋亡试剂盒购于ACTGene公司;酶标仪购于北京沃格东方科技有限公司;流式细胞仪购自广州泰勒生物科技有限公司;CO2细胞培养箱购自绵阳荣盛科技公司。特异性siRNA设计由上海闪晶生物科技公司合成。

1.3MUC5AC、IgE、IL-35表达检测 将鼻息肉组织及下鼻甲组织研磨,加入裂解液,在冰块上静置1 h,设定12 000 r/min离心20 min,取出上清液。根据试剂盒操作说明检测MUC5AC、IgE、IL-35的蛋白浓度。依次变性、电泳,凝胶,转膜,封闭。加入一抗,4 ℃孵育过夜,TBST缓冲液洗膜后加入羊抗鼠IgG,37 ℃孵育2 h。TBST清洗后加入电化学发光法(ECL)发光剂显影,凝胶成像。选定β-actin为内参,分析蛋白表达水平。

1.4鼻黏膜上皮细胞培养 将鼻息肉组织〔4〕,用PBS冲洗后加入含有蛋白酶的培养液中,在4 ℃中放置18 h后制成细胞悬液。加入锥虫蓝后稀释细胞悬液,在37 ℃,5%CO2的培养箱中培养1 h后放入细胞培养板中,加入转铁蛋白、胰岛素、霍乱霉素、氢化可的松、维生素A酸,三碘甲状腺氨酸、表皮生长因子、内皮细胞生长因子的培养基,隔天换液,培养3～4 d。

1.5细胞转染 将对数生长期的鼻黏膜上皮细胞接种于培养板中,然后加入细胞悬浮液培养24 h。并分为MUC5AC对照组、MUC5AC siRNA组及MUC5AC si-NC组,IgE对照组、IgE siRNA组及IgE si-NC组,IL-35对照组、IL-35 siRNA组及IL-35 si-NC组,分别转染磷酸盐缓冲液、200 ng/ml miR-21 mimic和200 ng/ml miR-NC,转染6 h后更换培养液。

1.6细胞凋亡检测 将细胞接种于孔板中,处理后用预冷的PBS清洗2遍细胞,加入缓冲液制成重悬细胞,加入5 μl膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(FITC-AnnexinⅤ)混匀后加入染料,室温下避光孵育15 min,将细胞悬浮液在流式细胞仪上检测,统计细胞凋亡率。

1.7凋亡蛋白caspase3检测 转然后细胞培养48 h,在冰上进行裂解反应,在12 000 r/min的离心机上离心15 min,收取上清液后用BCA试剂盒检测caspase3蛋白表达水平。

1.8统计学方法 采用SPSS22.0软件进行独立样本t检验、单因素分析。

2 结 果

2.1鼻黏膜上皮细胞培养情况 培养24 h后,细胞圆形,为贴壁生长时期,部分呈多角形;3 d后细胞多聚集生长,呈长梭形;6 d后细胞集落进一步增大、增多。见图1。

图1 鼻黏膜细胞生长情况(×200)

2.2鼻息肉组织相对蛋白表达 IL-35在鼻息肉组织中的表达显著低于鼻甲组织(P<0.05)。MUC5AC、IgE在鼻息肉组织中表达显著高于鼻甲组织(P<0.05)。见表1。

表1 MUC5AC、IgE、IL-35鼻息肉组织中表达比较

2.3转染后相对蛋白表达 MUC5AC、IgE、IL-35的si-NC组(1.31±0.40、0.74±0.31、0.59±0.06)转染与其相对应的对照组相对蛋白表达(1.32±0.42、0.78±0.36、0.60±0.03)差异无统计学意义(P>0.05)。在转染特异性siRNA后,其相对应的相对蛋白表达量(0.78±0.36、0.41±0.12、0.22±0.03)均明显降低(均P<0.05)。

2.4细胞凋亡变化 IL-35对鼻黏膜上皮细胞凋亡具有抑制作用,结果显示,IL-35 siRNA组细胞凋亡率〔(25.16±3.02)%〕显著高于si-NC组〔(17.85±2.37)%;t=4.661,P<0.01〕。MUC5AC可以促进鼻黏膜上皮细胞凋亡,MUC5AC siRNA组凋亡率〔(10.29±2.04)%〕明显低于si-NC组(t=5.920,P<0.01)。IgE siRNA组细胞凋亡率〔(8.22±1.84)%〕明显低于si-NC组(t=7.846,P<0.01)。见图2。

图2 各组转染后细胞凋亡的影响

2.5凋亡相关蛋白caspase3表达 IL-35 siRNA组caspase3表达量(1.21±0.07)相对于对照组(1.02±0.04)明显升高(P<0.05)。IgE siRNA组、MUC5AC siRNA组caspase3表达量(0.33±0.02、0.47±0.05)相对于对照组明显降低(P<0.05)。见图3。

1～4:对照组、IL-35 siRNA组、IgE siRNA组、MUC5AC siRNA组图3 各组凋亡相关蛋白caspase3表达

3 讨 论

慢性鼻-鼻窦炎是耳鼻喉科常见的一类鼻腔黏膜变性疾病,发病后会严重影响到患者生活质量及健康状况,主要临床特征有鼻塞、流脓涕、嗅觉下降及头痛〔4〕。鼻息肉是慢性鼻-鼻窦炎特殊类型,也是常见慢性炎症反应疾病。RNA干扰(RNAi)是特异性的RNA转录后出现基因沉默现象。在上世纪末期发现的RNAi其实是siRNA与对应的mRNA特异结合、降解来阻止mRNA翻译,引起生物细胞内同源基因发生特异性沉默,已经成为调控基因表达的方法之一〔5〕。研究RNAi技术对疾病发生和基因改变的机制,能够帮助专家进一步了解通过基因影响细胞,为从基因水平疾病治疗提供理论依据和思路〔6〕。

MUC是一类主要由多糖组成的糖蛋白,因其大分子结构影响黏液的流变学特性。已发现的20种黏蛋白中,绝大多数的黏蛋白的表达在人呼吸道黏膜中。MUC5AC被认为是呼吸道黏液的重要成分〔7〕。正常的人体中,多种黏蛋白对黏膜有着很大的保护作用,其中MUC5AC对气道黏液高分泌反应具有重要的指导意义,MUC5B可以清除病毒,具有非特异性免疫应答作用,MUC7对细菌具有清理作用〔8,9〕。本研究结果显示,鼻息肉组织中MUC5AC过表达,MUC5AC siRNA组成功诱导鼻黏膜细胞MUC5AC基因沉默,转染后免疫组化检测显示MUC5AC表达被靶向抑制。染色凋亡结果表明,下调MUC5AC可降低鼻黏膜细胞凋亡。caspase蛋白是细胞凋亡主要蛋白,其中caspase3是执行凋亡的启动者。通过激活caspase3,触发相关凋亡的蛋白表达。并且caspase3蛋白表达水平与临床多种疾病产生与发展过程密切相关,凋亡蛋白可能参与鼻息肉的发病过程。本研究结果提示,MUC5AC蛋白可能通过调控caspase3来影响鼻黏膜上皮细胞凋亡。

IgE如今大多数用于诊断过敏反应的主要指标〔10〕,虽然IgE在人类的血清中含量较少,但其在免疫炎症免疫反应中起重要作用〔11〕。IgE对鼻窦炎鼻息肉的发生有重要影响,IgE介导的过敏反应引起鼻炎、鼻窦疼痛、痒等多种症状。研究表明,IgE在鼻息肉中的表达水平增加,引发严重的嗜酸性炎症〔12,13〕。但IgE介导的鼻息肉促炎反应的调控机制仍有待充分研究。

IL-35作为自身免疫性调控因子在疾病中被研究,其作用是通过诱导T淋巴细胞的功能紊乱来抑制机体的免疫功能,同时还能够调节多类细胞因子〔14,15〕。IL-35参与疾病炎症反应发生,如哮喘和变应性鼻炎等,它在多种疾病表达有明显差异〔16,17〕。本研究结果推测,可能是IL-35通过抑制caspase3表达来抑制鼻黏膜细胞凋亡。有学者猜测〔18〕,IL-35通过诱导Treg细胞抑制免疫反应,所以鼻息肉组织IL-35表达水平也低于正常人。

综上,IL-35在鼻息肉组织中低表达,MUC5AC、IgE在鼻息肉组织中高表达,沉默MUC5AC、IgE的表达能抑制鼻黏膜细胞凋亡,沉默IL-35能促进鼻黏膜细胞凋亡。