LncRNA FOXD3-AS1靶向miR-127-3p对AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞的影响

杜美玲 王晓元 李会贤 李方江 李飞星

(河北北方学院附属第一医院心血管内科,河北 张家口 075400)

长链非编码RNA(LncRNA)是长度大于200 nt蛋白编码能力缺失的RNA转录本,其通过表观遗传、转录或转录后水平调控基因表达在细胞增殖、分化,迁移和侵袭等生物学过程中具有重要功能,LncRNA的表达改变与心脑血管疾病、肿瘤的进展密切相关〔1,2〕。叉头盒转录基因D3反义RNA1(FOXD3-AS1)是近年发现的LncRNA,研究发现FOXD3-AS1表达上调明显促进糖氧剥夺的心肌细胞凋亡和缺血/再灌注损伤〔3〕。胶质瘤、乳腺癌中FOXD3-AS1表达上调,具有促增殖、促迁移作用〔4,5〕。血管平滑肌细胞(VSMCs)是动脉粥样硬化等心血管疾病进展的重要步骤。但FOXD3-AS1在VSMCs中的表达和功能未见报道。生物信息学预测显示miR-127-3p是FOXD3-AS1的候选靶基因之一。miR-127-3p骨肉瘤组织中表达下调,上调miR-127-3p表达抑制骨肉瘤细胞的增殖,迁移和侵袭〔6,7〕。然而,FOXD3-AS1是否miR-127-3p参与调控VSMCs增殖、迁移、侵袭和凋亡尚未可知。本研究以血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导人主动脉VSMCs,探讨FOXD3-AS1在VSMCs增殖、迁移、侵袭及凋亡中的作用和潜在机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂 杜氏改良Eagle培养基(DMEM)和胰蛋白酶购于美国Gibco公司;AngⅡ购于美国Sigma公司;小干扰RNA(si-RNA)、过表达质粒(pcDNA3.1-RNA)、miRNA模拟物(miRNA mimics)、miRNA抑制物(anti-miRNA)、荧光素酶报告基因载体合成、构建和测序由上海吉玛制药公司完成;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)试剂盒购于大量Takara公司;CCK-8、膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)双染细胞凋亡试剂盒购于北京索莱宝生物技术有限公司;Transwell小室和基质胶购于美国Corning公司;兔源磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)单克隆抗体、兔源磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)单克隆抗体、兔源β-actin抗体单克隆购于美国CST公司;兔源细胞周期蛋白(Cyclin)D1单克隆抗体、兔源活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(C-caspase)-3多克隆抗体、兔源基质金属蛋白酶(MMP)2多克隆抗体、兔源MMP9多克隆抗体、山羊抗兔IgGⅡ抗购于美国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养和分组 人主动脉VSMCs购于上海信裕生物工程有限公司,用DMEM于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱培养,当细胞生长汇合度达到85%时,加入胰酶消化,磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后加入细胞培养液,接种于6孔板进行实验。分为对照(NC)组:正常培养的VSMCs;AngⅡ组:采用0.001 mol/L AngⅡ处理VSMCs 48 h;AngⅡ+si-con组:转染si-con后进行AngⅡ处理;AngⅡ+si-FOXD3-AS1组:转染si-FOXD3-AS1后进行AngⅡ处理;AngⅡ+miR-con组:转染miR-con后进行AngⅡ处理;AngⅡ+miR-127-3p组:转染miR-127-3p mimics后进行AngⅡ处理;AngⅡ+si-FOXD3-AS1+ anti-miR-con组:共转染si-FOXD3-AS1和anti-miR-con后进行AngⅡ处理;AngⅡ+si-FOXD3-AS1+anti-miR-127-3p组:共转染si-FOXD3-AS1和anti-miR-127-3p后进行AngⅡ处理。细胞转染参照脂质体LipofectamineTM2000说明书进行瞬时转染,收集转染48 h细胞进行AngⅡ处理。

1.2.2RT-qPCR检测FOXD3-AS1和miR-127-3p的表达水平 按照TRIzol使用说明提取各组HA-VSMC细胞的总RNA,逆转录试剂盒合成互补DNA(cDNA),以cDNA为模板,利用荧光定量试剂盒于ABI 7500型PCR仪上进行RT-qPCR扩增。FOXD3-AS1和miR-127-3p引物由上海生工公司合成,序列(5′-3′):FOXD3-AS1上游引物GAATAGTTGCCGA-GAGAAA,下游GACAGACAGGGATTGGGTT;miR-127-3p上游引物GGAAGATCTGTAGTCCTGTCTGTTGGTCAG,下游CCCAAGCTTCCTGAAGAACTGCTTCCGCC;β-actin上游引物AAGATGACCCAGATCA-TGTTTGAG,下游TAGATGGGCACAGTGTGGGTG;U6上游引物CTCGCTTCGGCAGCACA,下游AACG-CTTCACGAATTTGCGT。利用2-ΔΔCt法计算FOXD3-AS1和miR-127-3p的新的表达水平。

1.2.3CCK-8法检测细胞增殖 将各组将HA-VSMC细胞接种于96孔板,贴壁后,每孔加入10 μl的CCK-8试剂,37 ℃避光孵育4 h。酶标仪检测450 nm波长处各孔的吸光度(A)值,计算细胞存活率。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞,采用结合缓冲液制成1×106个/ml的细胞悬液。取100 μl的细胞悬液,分别加入5 μl的Annexin Ⅴ-FITC和5 μl的PI,室温下加入400 μl的结合缓冲液,混匀后1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡情况,见图1。

图1 凋亡细胞(×200)

1.2.5Transwell法检测迁移和侵袭迁移实验 无血清DMEM培养基稀释各组细胞为5×105个/ml细胞悬液,取300 μl加入到Transwell小室,24孔板下室加入500 μl的含20%胎牛血清的培养基,37 ℃培养箱孵育24 h,经多聚甲醛室温固定和结晶紫染色后,倒置显微镜下观察细胞过膜情况,随机选取3个视野,拍照记录细胞迁移细胞数目。侵袭实验:按照1∶8稀释的基质胶铺于在小室内,其他步骤参考迁移实验。

1.2.6双荧光素酶报告实验验证FOXD3-AS1和miR-127-3p的靶向关系 构建含有miR-127-3p结合位点的FOXD3-AS1的野生型(WT-FOXD3-AS1)和突变型(MUT-FOXD3-AS1)荧光素酶报告基因载体。将WT-FOXD3-AS1和MUT-FOXD3-AS1分别与miR-127-3p mimics和miR-con共转染至VSMCs细胞,转染48 h检测各组VSMCs的荧光素酶活性。为证实FOXD3-AS1对miR-127-3p的调控关系,将pcDNA3.1、pcDNA3.1-FOXD3-AS1、si-con、si-FOXD3-AS1分别转染VSMCs,转染48 h时RT-qPCR检测各组HA-VSMC细胞miR-127-3p的表达水平。

1.2.7Western印迹检测CyclinD1、C-caspase-3、MMP2、MMP9、p-PI3K和p-AKT的表达 裂解各组细胞,测定蛋白样品浓度。取等量蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,并转移至硝酸纤维素膜。膜封闭后,加入Ⅰ抗(β-actin和p-PI3K抗体1∶1 000稀释,p-AKT抗体1∶2 000稀释,其余为1∶500稀释)室温孵育2 h。加入Ⅱ抗(1∶2 000)低速摇床室温孵育1 h。化学发光显影后,以β-actin为内参,应用ImageJ软件测定各组细胞的灰度值。

1.3统计学分析 采用SPSS18.0软件进行t检验、方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1VSMCs中LncRNA FOXD3-AS1和miR-127-3p的表达情况 AngⅡ诱导后VSMCs中LncRNA FOXD3-AS1表达水平显著升高,miR-127-3p表达水平显著降低(P<0.001)。见表1。

表1 HA-VSMC中LncRNA FOXD3-AS1和miR-127-3p表达量

2.2抑制FOXD3-AS1表达对VSMCs增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响 与NC组比较,AngⅡ组VSMCs FOXD3-AS1表达、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达、细胞存活率、细胞迁移、侵袭能力显著升高,C-caspase-3蛋白表达、细胞凋亡率显著降低(P<0.05);与AngⅡ+si-con组比较,AngⅡ+si-FOXD3-AS1组VSMCs FOXD3-AS1表达、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达、细胞存活率、细胞迁移、侵袭能力显著降低,C-caspase-3蛋白表达、细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。见图2、图3、表2、图4。

表2 低表达FOXD3-AS1对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

图2 低表达FOXD3-AS1对细胞凋亡的影响

图3 低表达FOXD3-AS1对细胞迁移和侵袭的影响(结晶紫染色,×200)

1～4:对照组、AngⅡ组、AngⅡ+si-con组、AngⅡ+si-FOXD3-AS1组图4 低表达FOXD3-AS1对CyclinD1、C-caspase-3、MMP2、MMP9蛋白表达的影响

2.3过表达miR-127-3p对VSMCs增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响 与AngⅡ+miR-con组比较,AngⅡ+miR-127-3p组VSMCs miR-127-3p表达、C-caspase-3蛋白表达、细胞凋亡率显著升高,CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达、细胞存活率、细胞迁移侵袭能力显著降低(均P<0.001)。见图5、图6、图7、表3。

表3 高表达miR-127-3p对HA-VSMC细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

图5 过表达miR-127-3p对VSMCs凋亡的影响

图6 过表达miR-127-3p对VSMCs迁移、侵袭的影响(结晶紫染色,×200)

图7 过表达miR-127-3p对VSMCs相关蛋白的影响

2.4LncRNA FOXD3-AS1靶向miR-127-3p 双荧光素酶报告基因实验显示,与miR-con和WT-FOXD3-AS1共转染组比较,miR-127-3p mimcis和WT-FOXD3-AS1共转染组VSMCs相对双荧光素酶活性显著降低(P<0.05);与miR-con和MUT-FOXD3-AS1共转染组比较,miR-127-3p mimcis和MUT-FOXD3-AS1共转染组VSMCs相对双荧光素酶活性变化无统计学意义。见图8、表4。与pcDNA-con组(1.00±0.13)比较,pcDNA-FOXD3-AS1组VSMCs miR-127-3p表达水平显著降低(0.40±0.04,P<0.05);与si-con组(0.98±0.10)比较,si-FOXD3-AS1组VSMCs miR-127-3p表达水平显著升高(2.39±0.24,P<0.05)。4组差异显著(F=298.854,P=0.000)。以上结果提示LncRNA FOXD3-AS1靶向负性调控miR-127-3p表达。

表4 相对荧光素酶活性检测

图8 LncRNA FOXD3-AS1靶向miR-127-3p

2.5抑制miR-127-3p表达可以部分逆转抑制FOXD3-AS1对VSMCs增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响 与AngⅡ+FOXD3-AS1+anti-miR-con组比较,AngⅡ+si-FOXD3-AS1+anti-miR-127-3p组VSMCs miR-127-3p表达、C-caspase-3蛋白表达、细胞凋亡率显著降低,CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达、细胞存活率、细胞迁移、侵袭能力显著升高(均P<0.001)。见表5、图9、图10、图11。

表5 低表达miR-127-3p可以部分逆转FOXD3-AS1低表达对VSMC增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

1,2:AngⅡ+FOXD3-AS1+anti-miR-con组、AngⅡ+si-FOXD3-AS1+anti-miR-127-3p组;图10、图11同图9 抑制miR-127-3p表达可以部分逆转FOXD3-AS1对VSMCs凋亡的影响

图10 抑制miR-127-3p表达可以部分逆转FOXD3-AS1对VSMCs迁移和侵袭的影响(结晶紫染色,×200)

图11 各组CyclinD1、C-caspase-3、MMP2、MMP9蛋白表达

2.6PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达 与NC组比较,AngⅡ组VSMCs细胞p-PI3K和p-AKT表达水平显著升高(P<0.05);与AngⅡ组比较,AngⅡ+si-FOXD3-AS1组VSMCs p-PI3K和p-AKT表达水平显著降低;与AngⅡ+si-FOXD3-AS1+anti-miR-con组比较,AngⅡ+si-FOXD3-AS1+anti-miR-127-3p组VSMCs p-PI3K和p-AKT表达水平显著升高(P<0.05)。见表6、图12。

表6 各组PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达

1～5:对照组、AngⅡ组、AngⅡ+si-FOXD3-AS1组、AngⅡ+FOXD3-AS1+anti-miR-con组、AngⅡ+si-FOXD3-AS1+anti-miR-127-3p组图12 Western印迹检测各组PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达

3 讨 论

AngⅡ在体外具有诱导VSMCs增殖、迁移和侵袭的作用,采用AngⅡ刺激VSMCs是研究动脉粥样硬化常用的体外细胞模型。

FOXD3-AS1在高氧诱导的肺泡上皮细胞中表达上调,FOXD3-AS1高表达促进高氧诱导的肺上皮细胞死亡,加剧肺损伤〔8〕。FOXD3-AS1的上调与结肠癌患者的生存率较低相关,FOXD3-AS1可促进肿瘤生长,敲减FOXD3-AS1表达抑制肿瘤细胞增殖,迁移和侵袭及细胞周期并促进细胞凋亡〔9〕。然而在神经母细胞瘤组织和细胞系中FOXD3-AS1下调,高表达FOXD3-AS1可诱导神经元分化,降低神经母细胞瘤在体内外的侵袭能力〔10〕。本研究结果提示,FOXD3-AS1高表达可能与VSMCs细胞的异常生物学行为有关。MMP2和MMP9参与多种血管过程,其可催化和去除VSMCs周围的细胞外基质,促进从VSMC从静止状态向增殖和迁移的活跃状态转变〔11,12〕。本研究结果提示,干扰FOXD3-AS1表达抑制VSMCs的增殖、迁移和侵袭能力,诱导细胞凋亡,对遏制动脉粥样硬化进展具有一定积极意义。

LncRNA发挥miRNA分子海绵作用是近年来的研究热点,为进一步探讨FOXD3-AS1调控VSMCs生物学行为的分子机制,本研究采用生物信息学网站对FOXD3-AS1的靶基因进行预测,显示miR-127-3p是FOXD3-AS1的潜在靶点。研究显示miR-127-3p在连续注射阿霉素诱发的心脏功能障碍小鼠血浆中表达下调〔13〕。在肾脏缺血再灌注大鼠模型中,miR-127-3p是缺血后肾组织修复过程中HIF-1α的效应子〔14〕。此外,miR-127-3p在口腔鳞癌和上皮性卵巢癌中表达下调,过表达miR-127-3p可抑制体外肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,是口腔鳞癌和上皮性卵巢癌的潜在治疗靶标〔15,16〕。本研究结果提示,FOXD3-AS1通过调控miR-127-3p表达进而影响VSMCs的增殖、凋亡、迁移和侵袭。

PI3K/AKT信号通路在VSMCs的增殖、迁移和表型转换中具有重要作用,其激活可促进血管重塑性疾病的发生〔17,18〕。本研究提示FOXD3-AS1靶向miR-127-3p对VSMCs的增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响与调控PI3K/AKT信号通路有关。