白菜稳定新种质的创制与遗传分析

邵尤彬，陈纪鹏

（江西省作物生长发育调控重点实验室·宜春学院生命科学与资源环境学院 江西宜春 336000）

白菜原产于中亚、欧洲和北非等地，栽培历史悠久，遗传资源丰富。多种多样的类型和丰富的种质资源为白菜杂交育种创造了优越条件，近缘种间杂交可将不同类型的优良性状集中于同一杂种后代，获得品质好、产量高和抗性优良的白菜新品种。因此，研究白菜杂种后代减数分裂过程中染色体行为规律对白菜杂交育种、提高白菜品种品质和抗性具有重要意义。

白菜多数种类属于异花授粉植物，遗传组成复杂，具有较强的杂种优势[1]。不同类型间在农艺性状、生长势、抗性和适应性等方面差异较大，通过杂交可实现优势互补与品种改良。例如，不结球白菜不育系与5 份自交系杂交选育，杂种后代的多个农艺性状与双亲相比具有较好表现[2]。通过对白菜薹的10 个自交单株进行配合力测定，探索出影响白菜薹主要农艺性状的相关遗传因素，所得结果为白菜薹自交系的筛选和品种培育提供了重要依据[3]。白菜的颜色选育也是遗传改良的一个方向，紫心白菜的获得就是将紫色白菜与大白菜杂交，在杂种后代中选择到叶片正面紫色、背面及叶柄绿色的植株[4-5]。白菜黑腐病是一种常见病害，传播途径多样，影响白菜的产量和品质，是由黄单胞菌野油菜致病变种引起的细菌性病害[6]。通过白菜与埃塞俄比亚芥种间杂交已成功地将抗黑腐病性状转入白菜[7]。黄籽沙逊具有早熟、种皮薄、含油量高等黄籽油菜的优点，是用于甘蓝型油菜黄籽性状改良的理想材料[8]。白菜中还有较丰富的抗根肿病资源，在30 多份来自国内外的白菜品种中，经过抗病性鉴定，筛选出13 份抗性材料[9]。通过种间杂交和分子标记辅助选择，大白菜抗根肿病基因CRb已成功转入不结球白菜[10]和甘蓝型油菜[11]。具有抗根肿病特性的大白菜与普通白菜杂交，再经多代自交和回交，还选育出携带抗性基因的白菜近等基因系，可作为白菜抗根肿病育种的遗传资源[12]。

白菜单倍体减数分裂表现较多异常，第一次减数分裂（MI）前期染色体并不全以单价体形式存在，较多染色体形成二价体甚至三价体，大多数花粉母细胞内出现3 对二价体。中期染色体在赤道板位置排列并不整齐，有少部分染色体分布于赤道板以外。减数分裂结束时形成较多的三分孢子[13]。而在白菜的同源四倍体中，花粉母细胞减数分裂时染色体常形成多价体，偶尔形成单价体，并且在减数第一次分裂后期出现不均等分离的现象[14]。白菜与甘蓝型油菜杂种二代发生形态分离，出现了偏白菜的类型和偏甘蓝型油菜的类型以及中间类型。不同类型间染色体数目也不同，偏白菜类型染色体数目为20，减数分裂中平均每个花粉母细胞形成1.64个单价体、9.11 个二价体和0.04 个三价体。中间类型的植物染色体数目在23～28。偏甘蓝型植株染色体数目在29～38，平均每个花粉母细胞形成0.68 个单价体、18.23 个二价体和0.30 个三价体[15]。不同类型的白菜杂交获得的杂种染色体数目仍为20，花粉母细胞减数分裂正常，绝大部分细胞形成10 个二价体[16]。

当前广泛栽培的白菜品种虽然具有较好的综合性状，但大部分栽培品种的品质还有待进一步提高，多数种类抗病虫特性较差，尤其是菌核病对白菜等十字花科植物危害十分严重。有关白菜杂种减数分裂规律的研究较少，杂种后代的育性改良缺少理论依据。为了研究白菜杂种后代的遗传规律，创建有经济价值的白菜新种质，采用农艺性状具有较大差异的两种白菜作为亲本进行杂交，有望从杂种后代中筛选到农艺性状优良的新材料。两个亲本在形态上存在极大差异，黄芽白形体大，叶色白，结球性好；而矮抗青形体较小，叶色暗绿，不结球，二者具有很好的互补性。通过减数分裂过程观察，探索杂种细胞遗传学规律，找出减数分裂过程与花粉育性之间的关系，并对杂种后代进行菌核病抗性鉴定，为白菜杂交育种创建新材料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

矮抗青与黄芽白属于十字花科芸薹属植物，在进化和农业生产中形成不同的变种，在形态学方面有较大差异，具有不同的食用价值。黄芽白叶片大，易结球，单株质量大，不易抽薹；而矮抗青叶片肥厚，不结球，较易抽薹，单株质量较小。二者生长习性相近，都表现为生育期较短，不耐阴雨潮湿。2015 年秋季，亲本露天播种，第二年春季盛花期进行人工杂交并收获种子，经鉴定获得杂种一代。黄芽白作母本的杂交记为正交，杂种一代记作F1。以矮抗青为母本的杂交记为反交，杂种一代记作F'1。正反交杂种一代经过多代连续自交，于2020 年形成稳定新种质F5和F'5（图1）。将杂种后代在田间种植，开沟起垄，行距30 cm，株距20 cm，冬季做好排水工作。分别在2017 年和2021 年春季观察杂种F1、F'1和F5、F'5花粉育性、植株表型和花粉母细胞减数分裂特征，并于2021 年春季进行抗菌核病特性鉴定。

图1 杂种后代来源系谱

1.2 方法

1.2.1 人工杂交 2016 年春季，于白菜盛花期，选择无明显病虫害、生长健壮的植株作母本，用镊子将即将开放的花蕾剥开去除雄蕊，然后套上杂交专用纸袋。翌日上午取父本花粉为母本授粉。授粉后7 d 左右去掉纸袋，让其自然生长，待种子成熟后收取种子。

1.2.2 花粉育性观察 选择天气晴朗、气温较高时间段，一般在上午10：00 花粉活力最强，适合观察花粉育性。在田间取新开的花朵，每个材料选3株，每株取5 朵花用于观察。从花朵中取1～2 枚花药放于载玻片上并用镊子挤破花药，立即加1～2 滴醋酸洋红，用盖玻片盖好轻轻按压，然后放在显微镜（Nikon Eclipse 80i，日本）下观察。饱满、圆形、形体大、被染色程度深的为有活力花粉，反之则是无活力花粉。花粉育性以所观察的可育花粉占总观察花粉数的百分比表示。

1.2.3 杂种后代形态学观察 将亲本和杂种后代种植于田间，在幼苗期（10 片真叶）观察幼苗叶片形态特征。在终花期观察株型并统计分枝数量以及花器官各部分特征。成熟期统计植株结实情况，植株结实性以单株形成角果数和单角果结实数反映，单株结实数=单株角果数×每角果种子数。

1.2.4 花粉母细胞减数分裂观察 选择晴好、气温较高天气，上午11：00 左右取发育阶段适宜的花蕾，使用固定液（V无水乙醇∶V冰乙酸=3∶1）处理迅速杀死细胞，使染色体保持原有形态。将花蕾在固定液中处理24 h 以上，于-20 ℃冰箱中贮藏。从花蕾中取出花药于1 mol·L-1的HCl 溶液中，60 ℃水浴2 min，可有效去除细胞质干扰，观察染色体更清晰。然后将花药放在载玻片上用镊子压碎，再除去花药壁，滴加卡宝品红，盖上盖玻片，在光学显微镜（Nikon Eclipse 80i，日本）下观察。重点观察处于减数分裂不同阶段的花粉母细胞染色体行为，选取典型细胞拍照记录。

1.2.5 菌核病抗性鉴定 采用PDA 培养基培养菌核病（Sclerotinia sclerotiorum）病原菌，在25 ℃培养箱中培养，待菌丝长满培养皿后即可接种。选择菌核病高发阶段（白菜盛花期）进行茎秆接种，先在茎秆上钻小孔，再用牙签蘸些带有菌丝的培养基小块，将牙签插入小孔中，并用保鲜膜包扎防止雨淋或风干。每个材料随机选择5 株，每株接种3 个点，以当前主栽白菜品种丰抗90 作为对照。分别于接种后7、10 d 观察病斑大小，以沿茎秆病斑长度L为指标反映感病程度。测量结果与对照比较计算相对感病度S，即S=L/L对照，S值越大表示感病度越高（抗病性越弱），S值越小表示感病度越低（抗病性越强）。

1.3 数据统计分析

每个观察测量的性状设置5 个重复，获得的数据采用方差（ANOVA）和卡平方（χ2）进行分析，以平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 杂种后代形态学特征

正反交杂种一代（F1和F'1）营养生长旺盛，秋冬季生长迅速，形成的叶片与整个植株都比双亲高大。植株形态与亲本之间有较大差异，总体表现出偏黄芽白亲本特征。叶片形态表现出双亲的中间型，叶柄较双亲长，叶片大而平展，叶边缘平滑无叶裂。苗期株型为半直立，叶片斜向上伸展，整个植株明显大于双亲（图2-A～C）。与双亲相比，杂种一代植株抽薹较早，所形成菜薹肥大粗壮，适合食用。生育后期形成较多分枝，多为基部分枝，株型紧凑，以矮抗青为母本的杂种后代F'1和F'5平均形成19 个分枝，而双亲只有12～13 个分枝。开花后形成大量角果，F'1和F'5单株形成角果数分别达359.9 和391.2 个，而双亲单株形成角果数仅有180～190 个。虽然单角果形成种子数不如双亲，但单株结实数比亲本明显提高。正交和反交产生的杂种后代表型非常相似，只是反交杂种后代植株生长更旺盛，叶片大，分枝多，植株高，在叶片表面颜色和光滑度上也有差异。而正反交杂种后代的花粉育性和结实性无明显差异（表1）。

表1 杂种后代形态和育性特征

图2 杂种后代表型和花粉特征

经多代自交形成的高世代杂种（F5和F'5）在形态上未发生较大变化，叶片形态与株型都与杂种一代相似，只是植株营养生长更旺盛，植株更高大。尤其是反交杂种后代F'5叶片肥大，生长快，单株质量大，具有极大的生产潜力，叶片连同叶柄长度达到50 cm 左右，株高达155.1 cm，分枝数平均19个。经过多代自交花粉育性仍未能恢复到亲本水平，每角果种子数比亲本略低，但由于植株高大，形成较多角果，单株结实数比亲本高（表1）。

2.2 花粉母细胞减数分裂染色体联会情况

杂种后代植株染色体数目与亲本一致，均为20条染色体，未发现染色体数目变异植株。在同一花药中细胞分裂基本同步，绝大多数细胞处于同一分裂阶段。在MI前期，染色质凝缩成细丝状（图3-A）。随着减数分裂过程延续，染色体形态更加清晰，联会状况可清晰辨认出来，但由于染色体凝缩程度不够，只能观察到多条染色相互联接（图3-B）。

图3 杂种花粉母细胞MⅠ前期染色体行为

到终变期，染色体形态进一步凝缩，是观察染色体联会的最佳时机。二价体是杂种后代染色体联会的主要构型，平均每个花粉母细胞形成7.0～8.5个二价体，个别细胞中也观察到四价体。二价体的形态主要有环状和棒状两种构型，环状二价体是由同源染色体之间形成2 个交叉点而引起的，而棒状二价体则是同源染色体之间只形成1 个交叉点，二价体交叉的数量可在一定程度上反映同源染色体联会的紧密程度（图3-C）。杂种后代平均每个花粉细胞形成3～5 个环状二价体和3～4 个棒状二价体。而两个亲本矮抗青和黄芽白每个细胞平均形成环状二价体的数目分别为5.5 和5.2 个，而棒状二价体的平均数分别为3.7 和4.4 个（表2）。杂种后代中，F5形成环状和棒状两种形态的二价体数量相同，其他杂种均形成较多的环状二价体。但与亲本相比，环状二价体的数量偏低。除二价体外，还有少数四价体形成，杂种后代平均每个细胞形成0.6～1.3 个四价体，而矮抗青和黄芽白形成四价体的平均数分别为0.4 和0.2 个。四价体多以两个环状二价体之间由部分染色质相连形成“8”字形四价体（图3-D）。杂种后代中形成四价体的比例比亲本高，同时，杂种后代中还以极低的比例（平均每个细胞0.1 个）出现其他染色体联会构型（除四价体之外其他类型的多价体），而在亲本中未发现其他染色体联会构型（表2）。染色体联会情况表明，在杂种后代同源染色体联会过程中出现较多的多价体等异常情况，所形成的二价体交叉数偏少，也表明同源染色体联会不够紧密。

表2 杂种花粉母细胞MⅠ前期染色体联会

正反交杂种后代之间的花粉母细胞染色体联会情况非常相似，形成二价体的比例无显著差异，都以较低的比例出现四价体以及其他类型的多价体。经过多代自交形成的高世代杂种花粉母细胞形成二价体的比例比杂种一代高，而形成四价体的比例较低。表明经过多代自交，在减数分裂过程中染色体联会更加正常。

2.3 花粉母细胞减数分裂后期染色体分离

在杂种后代花粉母细胞MI和MⅡ中期，染色体整齐地排列于赤道板位置，但在少数细胞中也出现少数染色体停留在其他区域，与其他染色体不同步（图4-A～B）。MI后期，配对的染色体发生分离，并在纺锤丝的牵引下移向细胞两极，83%～86%的花粉母细胞染色体发生均等分离，即染色体10∶10 分开，而两亲本发生均等分离的细胞数分别占95%和97%。但不均等分离的情况也以较低频率发生，如11∶9 和12∶8 分离方式（表3）。不同杂种后代发生均等分离的细胞比例和发生不均等分离的细胞比例相近，但与亲本相比，发生均等分裂的细胞比例小，而发生不均等分离的细胞比例更大。这也是杂种后代减数分裂异常的一个表现。

表3 杂种后代花粉母细胞后期染色体分离

图4 MⅠ 和MⅡ中期和后期染色体分离行为

在MI后期同源染色体分开过程中，发现有个别染色体落后现象。在杂种后代中，在最低3%比例最高12%比例的细胞中发现落后染色体，而在亲本中极少观察到包含落后染色体的细胞（表3）。在有些细胞中还发现由于同源染色体不能及时分裂而形成染色桥的现象（图4-C）。而杂种后代中出现后期染色体桥的细胞占总观察细胞数的4%～10%（表3）。中后期桥和落后染色体的出现势必影响配子的形成，造成部分花粉败育。而在两个亲本中，这种染色体落后情况极少出现，也没观察到染色体桥的发生。后期染色体分离过程的异常也可能引起杂种后代花粉育性降低。

所有杂种后代花粉母细胞经过减数分裂，同源染色体和染色单体分开形成具有四个核的四分孢子，未发现有其他情况（三分孢子和五孢子）出现（图4-D）。与杂种一代相比，经过自交形成的高世代杂种花粉母细胞中，不均等分离、落后染色体和染色体桥等异常情况显著减少，与亲本相比，染色体行为仍然存在较多异常，虽然最终都形成四分孢子，但仍然对配子育性有一定影响。

2.4 小孢子发育过程

减数分裂完成后，杂种所有花粉母细胞形成四分体，即新形成的4 个小孢子被包裹在一起，后期，小孢子释放出来继续发育。初期小孢子体积较小，平均直径在15.0 μm 左右，后来小孢子体积不断增大，平均直径达到20.0 μm，此时小孢子进入单核靠边期，细胞核被中央大液泡排挤到细胞边缘，此时花蕾长度达（5.6±1.1）mm，而在相同小孢子发育时期，亲本花蕾长度为（4.5±1.3）mm。与亲本相比杂种小孢子处于单核靠边期的花蕾体积偏大，经卡平方（χ2）检测二者之间在0.05 水平上存在显著差异。这表明杂种营养生长更加旺盛，而生殖生长相对较迟。

当花蕾长度达到6.0 mm 时，杂种小孢子发育进入三核期，细胞核较大，仍位于细胞边缘（图4-B）。与单核期相比，小孢子直径进一步增大，达到（25.0±1.3）μm，此时小孢子发育成熟。与亲本相比，杂种成熟的小孢子直径大小一致，二者之间在0.05 水平上无显著差异，这表明杂种小孢子发育正常。但杂种正常发育的小孢子数量只占总数的93%，另外7%体积较小，发育迟缓，而亲本全部小孢子均发育正常。

2.5 杂种后代菌核病抗性

分别对杂种一代（F1与F'1）和高世代杂种（F5与F'5）进行茎秆接种菌核病病原菌鉴定杂种抗病性，接种后7 d 和10 d 沿茎秆测量形成病斑长度，并以大白菜丰抗90 为对照计算相对感病度。所有待检测材料在接种点均形成病斑，颜色黑暗，早期呈圆形，后期沿茎秆扩大，呈椭圆形。病斑生长速度较快，接种7 d 后病斑平均长度为3.74 cm，接种10 d 后，病斑平均长度为6.09 cm。随着病斑的继续生长，植物茎秆组织坏死，后期病斑部位长出肉眼可见的菌丝，植物茎秆腐烂，极易折断。通过病斑长度和相对感病度测算，矮抗青亲本表现为抗病，接种后7 d 和接种后10 d 的病斑长度都显著小于对照，相对感病度也显著小于对照。而黄芽白亲本接种后7 d 病斑长度大于对照，接种后10 d 的病斑长度与对照无差异。杂种后代中只有杂种后代F'5形成病斑长度和相对感病度明显低于对照，表明其与对照相比有较好的菌核病抗性，而另外3个杂种抗病性与对照相比无显著差异（表4）。

表4 杂种的茎秆菌核病抗性鉴定

3 讨论与结论

本研究中两种形态差异较大的白菜杂交所产生的杂种后代在生长势和植株形态上表现出明显的生长优势，茎叶等营养器官明显比双亲大，单株质量也远超过两亲本。近缘种杂交后代营养生长旺盛现象也在多种植物杂交中发生，白菜与萝卜杂种后代就表现出营养器官生长旺盛的特征，进一步对转录组和代谢组研究发现，在杂种体内发生了大量的转录和代谢的改变，表明杂种的营养生长伴随着基因表达和代谢的变化，但杂种营养生长旺盛的遗传机制仍不清晰[17]。拟南芥杂种后代在叶片大小、分枝数量、种子产量等方面也存在优于双亲的特征，而且拟南芥表现出的这种特征与亲本亲缘关系远近无相关性[18]。但芸薹属白菜和甘蓝与其近缘种杂交后代的种子产量却与亲本的亲缘关系表现出负相关的关系[19]。在表现较强生长优势的拟南芥杂种研究中发现与光合作用有关的基因上调表达，这些上调表达的基因往往是参与叶绿体形成的基因或参与光合作用过程的基因，同时发现杂种叶片中叶绿体数量增多，光合作用速率加快[20]。白菜杂种后代表现出营养器官生长旺盛，发生在植株生长的早期，叶绿体合成相关基因在发芽后2 d 就开始上调表达，在种子萌发过程中一系列的代谢活动的改变可能是杂种旺盛生长的基础[21]。甘蓝型油菜杂种也表现出植株发育早期光合作用相关基因表达与杂种营养生长旺盛有关的现象[22]。

白菜不同亚种和变种染色体组虽然都来自同一祖先，包含相同数目的染色体，但在长期进化过程中必然会产生差异，影响杂种减数分裂过程中染色体同源联会过程。本研究中二倍体杂种的染色体来自不同变种的白菜，在减数分裂过程中主要发生同源联会形成二价体，但同时也会发生四价体等多价体联会构型，异常联会情况比亲本频繁，这表明不同来源的染色体影响同源联会过程。同一染色体内不同染色体间也可能存在部分同源关系，白菜单倍体在减数分裂过程中10 条染色体可形成1个三价体、2 个二价体和3 个单价体[23]。甘蓝型油菜单倍体染色体联会时也观察到同一细胞中发生2个A 染色体组形成的二价体，表明A 染色体组中的10 条染色体存在部分同源关系[24]。同一染色体组内不同染色体间的部分同源性可能影响二倍体杂种染色体同源联会，在减数分裂时形成多价体。有研究表明，合成杂种的染色体组结构也影响染色体同源联会，在芸薹属合成种间四倍体杂种（AABC、ABBC 和ABCC）中，同源染色体主要发生同源联会，但也有染色体组内不同染色体间的联会和不同染色体组间联会的情况[25]。白菜与甘蓝型油菜合成三倍体杂种（AAC）中所有A 染色体组发生同源联会的花粉母细胞只占71%[26]。还有研究表明，杂种减数分裂中染色体行为紊乱与相关基因表达情况有关系。以甘蓝型油菜与甘蓝为亲本合成的三倍体杂种（ACC）中，减数分裂过程很不正常，减数分裂中期染色体排列混乱，后期形成落后染色体和染色体桥，同时发现杂种体内与减数分裂相关的基因发生下调表达，这说明减数分裂过程中染色体行为受相应基因表达的影响[27]。细胞周期相关蛋白表达丰度也影响减数分裂过程中的染色体行为，例如染色质结构和动力学、细胞周期控制、细胞分裂、染色体联会和细胞骨架等，相关蛋白等指标常优先上调表达，在白菜同源多倍体中表达丰度下降，从而同源多倍体白菜在减数分裂过程中染色体联会形成单价体或多价体，染色体排列和分离时出现异常现象[19]。减数分裂是形成配子的关键步骤，在人工合成杂种细胞内来自不同亲本的遗传物质进入同一细胞势必引起减数分裂过程紊乱，而异常的减数分裂往往引起配子的败育[28]。鱼腥草减数分裂过程11.8%的花粉母细胞出现落后染色体、微核、不均等分离和非四分孢子等现象，而可育花粉仅1.5%[29]。马铃薯杂种的花粉育性与花粉母细胞减数分裂过程中形成二价体数目呈正相关[30]。

通过甘蓝与合成芸薹属六倍体杂交已成功将甘蓝的菌核病抗性基因转入甘蓝型油菜[31-32]。经过多代自交后，从F'5中筛选到对菌核病有较强抗性的材料。由于双亲中矮抗青具有较好抗性，因此可推测此抗性的获得源自母本矮抗青。杂种后代的形态、生理等层次的性状表现具有多样性，有些性状表现为双亲的中间型，有些性状可能表现出超亲型，有些性状表现为偏亲型（即某一性状与双亲之一相近）[33]。杂种后代某些性状偏某一亲本的现象比较普遍，比如野生玫瑰与黄刺玫种间杂种的花冠大小就完全遗传了母本（野生玫瑰）的特征[34]。

通过杂交和连续自交获得的白菜杂种丰富了白菜遗传改良遗传资源，尤其是所获得的菌核病抗性较强的杂种为白菜杂交育种创造了良好材料，通过进一步筛选有望获得白菜新品种，杂种花粉母细胞减数分裂规律的揭示也为白菜杂交育种提供了理论依据。