SUMO特异性蛋白酶1和ER在子宫内膜样腺癌组织中的表达和两者之间关系的研究

李云辉 朱博文 崔鑫

1洛阳市中心医院妇科，洛阳 471000；2洛阳市第三人民医院妇产科，洛阳 471002；3洛阳市中心医院病理科，洛阳 471000

子宫内膜癌是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤，好发于围绝经期和绝经后女性。中国每年有接近8 万的新发病例，致死率仅次于卵巢癌和宫颈癌［1］，严重危害女性的健康。虽然子宫内膜癌的诊治已进入分子检测时代，但是由于基层医院条件限制，分子实验室以及人才梯队尚未成熟，往往更多地依赖于传统组织学分型，传统组织学分为Ⅰ型和Ⅱ型［2］。I型子宫内膜癌的发生主要与雌激素（ER）相关，在I 型子宫内膜癌中最常见的组织学类型为子宫内膜样腺癌。子宫内膜样腺癌的病因及发病机制尚未明确。目前，研究发现PTEN、PAX-2、P53等基因突变及微卫星不稳定性均与其发病密切相关［3-5］。

小泛素相关修饰物（small ubiquitin related modifier，SUMO）是一种主要位于真核生物中高度保守的能够参与蛋白质小泛素化相关修饰的一类蛋白［6］，把SUMO蛋白通过与底物蛋白的共价结合调节靶蛋白的功能这一过程称为SUMO 化修饰［7］。SUMO 化修饰是一个动态可逆的过程。逆反应是指把SUMO 蛋白和靶蛋白分离的过程，在这个逆反应过程中SUMO 特异性蛋白酶（SUMO-specific proteases，SENPs）发挥着关键作用。SENPs 参与多种肿瘤的发生发展［8］。在SENPs 家族中，SENP1 是最重要也是目前研究最多的一种，它能够催化大量SUMO 和靶蛋白分离。研究发现：SENP1 在结直肠癌、前列腺癌、膀胱癌等组织中高表达［9-11］，但其在子宫内膜癌中的表达以及是否和ER 的表达存在相关性尚无相关报道。因此，本研究拟通过相关试验研究分析SENP1 和ER 在子宫内膜样腺癌中的表达和两者之间的关系，探讨SUMO 化修饰在子宫内膜样腺癌发生发展中的作用，进一步探索子宫内膜癌的发病机制，为患者的治疗提供依据。

材料与方法

1.主要材料和试剂

正常子宫内膜上皮细胞株，子宫内膜癌细胞株（ishikawa），DMEM 细胞培养基，（Gibco 公司，美国），胎牛血清（Gibco 公司，美国），Fast SYBR Green 聚合酶链式反应（PCR）试剂盒（天根生化科技有限公司，中国），BCA 蛋白定量试剂盒和增强型RIPA 裂解液（博士徳公司，中国），SENP1 抗体（EPR3844；Abcam，英国），GAPDH 抗体（Abcam，英国），DAB（威佳科技，中国），山羊血清封闭液（浩然生物科技，中国），苏木素（博谷生物科技，中国），Fulvestrant（氟维司群，MCE）。

2.方法

2.1.临床样本收集 选取2018 年10 月至2020 年10 月在洛阳市中心医院行手术切除的子宫内膜样腺癌组织和正常子宫内膜组织各80 份，把收集到的标本分别进行SENP1（工作浓度1∶700）和ER（工作浓度1∶400）免疫组化染色。收集患者病例信息，对患者进行长期随访，详细了解患者的治疗情况及预后情况。所有标本的病理诊断及免疫组化的判读均由洛阳市中心医院病理科2 位副主任医师独立证实。

本 研 究 经 医 学 伦 理 委 员 会 审 批 通 过（LWLL-20230216）。

2.2.细胞培养与筛选 正常子宫内膜上皮细胞和ishikawa 分别培养于含10%胎牛血清的DMEM 培养基中，培养环境为37 ℃、5% CO2，且饱和湿度。根据细胞生长情况，约每3 d 按1∶2 比例进行细胞传代，分为试验组和对照组，试验组加入氟维司群（储备液浓度10 μmol/L，每毫升DMEM培养基加入1 μl储备液），作用时间48 h。

2.3.RNA 提取和逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测SENP1 和ER 的mRNA 的表达量 将培养24 h 后的细胞使用Trizol 裂解提取总RNA。通过Nano Drop 2000 分光光度计测定总RNA 的浓度和纯度。使用天根生物试剂盒逆转录总RNA 合成cDNA，并添加去DNA 试剂以消除基因组DNA 污染。采用SYBR Green Ⅰ荧光染料法进行PCR，扩增条件如下：95 ℃预变性5 min，随后94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s 和72 ℃ 30 s，共40 个循环。通过熔解曲线分析验证PCR 的扩增效率。使用2-ΔΔCt 方法计算靶基因的相对表达水平，PCR 引物序列如下。 ER 引物序列：正向引物GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG， 反向引物TGGCTGGACACATATAGTCGTT。SENP1引物序列：正向引物 AAGATTCCCAGACTCCAACTCCCA， 反 向 引 物TGAATGTTCCCGCTCCTGCAAT。

2.4. 蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测SENP1 和ER 蛋白表达水平 按照试验分组和对照组分别给予相应药物浓度处理；48 h 后用加有200 mmol/L N-乙基马来酰亚胺的裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，用4%～20%分离胶进行蛋白分离，冰浴下120 V 转膜90 min，室温下将膜置于5%脱脂奶粉中封闭1 h，然后分别加入抗体SENP1（1∶1 000）、ER（1∶2 000），4 ℃环境下孵育过夜，次日以1∶500稀释的二抗孵育1 h，以超信号蛋白检测试剂盒检测蛋白表达，凝胶成像系统扫描光密度值，Image J 软件进行定量分析。以GAPDH（1∶1 000）为内对照，以目的蛋白条带GAPDH 蛋白条带的比值计量各蛋白表达水平。

3.统计学分析

运用GraphPad Prism 9 软件对所得数据进行统计学分析，两组间比较采用独立样本t检验，相关分析采用Pearson相关系数，计量资料符合正态分布，所有实验均重复3 次，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.SENP1和ER在子宫内膜样腺癌组织中高表达

子宫内膜样腺癌组织SENP1 和ER 蛋白表达高于正常子宫内膜组织，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图1、图2、表1。

图1 小泛素相关修饰物特异性蛋白酶1在正常子宫内膜组织中的表达（免疫组织化学染色 ×100倍）

图2 小泛素相关修饰物特异性蛋白酶1 在子宫内膜癌组织中的表达（免疫组织化学染色 ×100倍）

2.RT-PCR检测结果

子宫内膜癌细胞SENP1 和ER 表达均高于正常子宫内膜上皮。通过采用ER特异性抑制剂（氟维司群）抑制ER的表达后，SENP1 在子宫内膜癌细胞株中mRNA 的表达量明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3、图4。

图3 SENP1、ER 在正常子宫内膜上皮、子宫内膜癌细胞中的表达

图4 子宫内膜癌细胞中加入ER 抑制剂前后SENP1、ER的表达

3.Western blotting结果

SENP1 和ER 在子宫内膜癌细胞中的蛋白表达均高于正常子宫内膜上皮细胞中［（0.11±0.04）比（1.04±0.06）、（0.67±0.10）比（1.57±0.5）］；加入氟维司群抑制ER 的表达后，SENP1在子宫内膜癌细胞株中的蛋白表达明显下降，子宫内膜癌细胞组SENP1 和ER 蛋白相对水平高于子宫内膜癌细胞+抑制剂组［（1.11±0.06）比（0.14±0.04）、（0.65±0.06）比（0.18±0.05）］，两者之间具有正相关性，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见图5、图6。

图5 SENP1、ER 在子宫内膜癌细胞组和正常子宫内膜上皮细胞组中的表达

图6 SENP1、ER 在子宫内膜癌细胞组和子宫内膜癌细胞+抑制剂组中的表达

讨论

蛋白质的翻译后修饰（post-translational modifications，PTMs）是蛋白质功能调控的重要方式，在多种细胞信号转导和生物学发育过程种发挥着重要作用。PTMs 方式多样，主要包括甲基化、磷酸化、乙酰化、泛素化、类泛素化等［12］。SUMO 是一种在真核生物中广泛存在且高度保守的类泛素蛋白，通过与底物蛋白共价结合动态可逆性修饰靶蛋白，这一动态可逆的过程称为SUMO 化修饰［7］。SUMO 化修饰作为一种重要的类泛素化蛋白修饰，参与调节靶蛋白细胞定位和功能，调节细胞核内蛋白的定位和转录因子的活性。SUMO 修饰的异常调控与肿瘤性疾病、病毒感染性疾病、代谢性疾病等密切相关［8］。去SUMO 化的过程是指通过去SUMO化酶的作用把SUMO亚基从底物蛋白上解离的过程。在去SUMO 化酶中，SENPs 家族是最重要的一类，发挥着关键作用。在SENPs 家族成员中，SENP1 是最先被引用和报道的，也是研究最多的一种。SENP1参与修饰广泛的底物，能够催化大量SUMO化蛋白去SUMO化［13-14］。

子宫内膜癌传统分型包括世界卫生组织组织学分型及Bokhman分型。Bokhman分型根据是否与雌激素相关，将子宫内膜癌分为Ⅰ型和Ⅱ型［2］。Ⅰ型为雌激素依赖性，主要是由雌激素长期刺激导致，在围绝经期或绝经后女性中发病率较高。I型子宫内膜样癌早期常缺乏明显的临床症状，容易被忽视，致使一部分患者确诊时已错过最佳的治疗时机。目前，研究发现，子宫内膜癌发生的高危因素主要包括雌激素用药史、他莫昔芬用药史、不孕症、肥胖、恶性肿瘤病史或家族史等［15］，但是具体发病机制仍存在很多争议。研究比较多的靶点主要有PTEN 的缺失、TP53突变、DNA 错配修复（MMR）蛋白缺失、POLE突变等［16-18］。

SENP1 与多种肿瘤的发生密切相关。在不同的肿瘤中，SENP1的靶点也存在多样性：在前列腺癌中的靶点主要是作用于前列腺素受体和剪接因子相关蛋白；在睾丸癌中主要调节生殖干细胞转录因子OCT4 的蛋白活性［19-20］。我们的前期研究发现：SENP1在子宫内膜样腺癌中高表达，但是具体机制尚未深入探究。我们推测：在子宫内膜样腺癌中，SENP1 和ER 存在相关性，共同促进了肿瘤的发生。本研究通过氟维司群抑制ER的表达，发现SENP1无论是蛋白水平还是mRNA 水平均显著下降，故证实SENP1 在子宫内膜样腺癌中的作用与ER 有关，并且可能发挥着协同作用。下一步我们将继续探究SENP1对子宫内膜样腺癌生物学功能的影响，以期能够更深入地了解SENP1 在子宫内膜样腺癌中的作用机制。

综上所述，SENP1 在子宫内膜样腺癌中高表达，并且SENP1对子宫内膜样腺癌的作用与ER 是正相关的，但其具体的作用机制仍需进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突