基于UPLC-Q-TOF/MS技术分析加味左金丸化学成分及指纹图谱研究

陈会朋，王 银，余惠旻，周红祖

基于UPLC-Q-TOF/MS技术分析加味左金丸化学成分及指纹图谱研究

陈会朋1，王 银1，余惠旻2*，周红祖3*

1. 北京中医药大学深圳医院（龙岗），广东 深圳 518116 2. 深圳大学医学院，广东 深圳 518060 3. 深圳市中医院，广东 深圳 518033

采用 UPLC-Q-TOF/MS 技术对加味左金丸中的化学成分进行定性分析。色谱柱为ACQUITY Premier BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流动相为乙睛-甲醇-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱，体积流量为0.3 mL/min；质谱的离子源为ESI，模式为正、负离子模式。通过质谱给出的分子离子峰和二级质谱碎片离子峰，结合对照品的相对保留时间，参考相关的文献，对于加味左金丸中的化学成分进行鉴定。并建立不同批次加味左金丸样品的指纹图谱。通过对数据的分析，从加味左金丸中鉴定出92个成分，其中包括16个有机酸类成分、34个黄酮类成分、17个生物碱类成分、21个萜类成分与4个其他类成分。建立的加味左金丸指纹图谱有13个共有峰，分别为黄芩苷、山柰酚-3--葡萄糖苷、槲皮素、汉黄芩素、甘草素、千层纸素A、芍药苷、吴茱萸次碱、小檗碱、巴马汀、枸橘苷、橙皮苷、柴胡皂苷d。指纹图谱方法的精密度、稳定性、重复性良好，多批次加味左金丸的成分基本一致。建立的UPLC-Q-TOF/MS方法对化学成分进行了鉴定，建立的指纹图谱方法为进一步分析加味左金丸的物质基础提供了重要依据。

HPLC-MS；加味左金丸；裂解规律；指纹图谱；黄芩苷；山柰酚-3--葡萄糖苷；汉黄芩素；甘草素；千层纸素A；芍药苷；吴茱萸次碱；小檗碱；柴胡皂苷d

中成药由于由多个中药材组成，同时经过多次提取分离，其化学成分相对较为复杂，研究难度比较大。采用传统的提取分离鉴定手段，不仅周期长、效率低，同时还不能比较全面地进行分析研究。UPLC-Q-TOF/MS的分析技术作为目前一种快速分析中成药、中药材、中药提取物中化学成分的手段，因其高灵敏度、高效、准确的特点，被广泛应用于中药的定性研究中[1-4]。UPLC-Q-TOF/MS一方面可以对相对分子质量进行精确分析，结合数据库可推导化合物结构，另一方面可以进行二级质谱分析，通过二级质谱中碎片峰，进一步确证其结构，定量与定性双重分析手段提高了化合物结构确证的准确性。

加味左金丸收载于《中国药典》2020年版，由黄连（姜炙）、吴茱萸（甘草炙）、黄芩、柴胡、木香、香附（醋炙）、郁金、白芍、青皮（醋炙）、枳壳（去瓤麸炒）、陈皮、延胡索（醋炙）、当归、甘草14味中药材组成，具有平肝降逆、疏郁止痛的功效[5]，临床上用于胃炎、胃溃疡、结肠炎等[6-13]，同时具有抗肿瘤的活性[14]。目前，通过文献调研，加味左金丸的成分研究只限于指标含量的测定[15]，未见到对其化学成分进行系统和深入的研究。课题组在前期已经对其进行了指标成分的定量研究与无机元素的分析研究[15-16]，在此基础上为了进一步剖析其物质基础与有效成分。本实验采用高分辨质谱对其含有的化学成分进行定性分析，对该中成药中化学成分进行精确的相对分子质量测定，通过质谱裂解规律，进而确定其分子式，同时结合参考文献与对照品准确定位，为加味左金丸的系统深入研究提供研究的基础。最后，进一步通过建立指纹图谱，为该中成药的质量控制提供依据。

1 仪器与材料

1290 Infinity II液相色谱系统（美国Agilent公司）；1260液相色谱系统（美国Agilent公司）；6230 B飞行时间（TOF）液质联用系统，MassHunter Acquisition 色谱工作站（美国Agilent公司）；Arium®水纯化系统（德国Sartorius公司）；Secura125-1C型电子天平（德国Sartorius公司）；SB-1200DT型超声波清洗器（宁波新芝超声波仪器有限公司）。

对照品阿魏酸（批号110773-201313，质量分数99.4%）、芍药苷（批号110736-201842，质量分数97.4%）、黄芩苷（批号110715-201821，质量分数95.4%）、木香烃内酯（批号111524-201710，质量分数99.5%）、去氢木香内酯（批号111525-201912，质量分数99.6%）、延胡索乙素（批号110726-201819，质量分数99.8%）、吴茱萸次碱（批号110801-201608，质量分数99.7%）、盐酸小檗碱（批号110713-201814，质量分数86.7%）、盐酸巴马汀（批号110732-201812，质量分数97.6%）、吴茱萸碱（批号110802-201710，质量分数99.6%）、柚皮苷（批号110722-201815，质量分数91.7%）、橙皮苷（批号110721-201818，质量分数96.2%）、柴胡皂苷a（批号110777-201912，质量分数94.8%）、柴胡皂苷d（批号110778-201912，质量分数96.3%）、槲皮素（批号100081-201610，质量分数98.6%）、汉黄芩素（批号111514-202207，质量分数98.6%），均购自中国食品药品检验研究院。山柰酚-3--葡萄糖苷（批号221011，质量分数99.6%）、甘草素（批号220517，质量分数99.8%）、千层纸素A（批号220106，质量分数99.5%）、枸橘苷（批号220803，质量分数99.6%），购自深圳惠达生物科技有限公司。

加味左金丸为北京同仁堂制药有限公司生产，批号为1903226、1705061、1705062、1705063、1903501、2005041、2007112、2009021、2011011、2012012、2103022、2105103、2107124、2109121、2111202，分别编号为S1～S15。甲醇、乙腈，色谱纯，默克公司。水为超纯水，其他试剂均为分析纯。2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱为ACQUITY Premier BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相A为乙腈-甲醇1∶1，B为0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～3 min，5% A；3～10 min，5%～20% A；10～15 min，20%～40% A；15～20 min，40%～60% A；20～30 min，60%～80% A；30～38 min，80%～90% A；体积流量为0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量3 μL。

2.2 质谱条件

离子源为ESI源，采集模式正离子与负离子模式，离子扫描范围为/100～1500，干燥气温度360 ℃，干燥气体积流量10 L/min，雾化器压力400 kPa，裂解电压175 V，毛细管电压3500 V，碰撞能量30 eV。

2.3 溶液的制备

2.3.1 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称定质量，超声30 min（功率250 W、频率40 kHz），放冷，用50%甲醇补足减失质量，摇匀，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3.2 药材溶液的制备 按加味左金丸处方比例和工艺，分别制备含单味药材的样品，并按“2.3”项下方法制备各药材溶液。

2.3.3 对照品溶液的制备 精密称取各对照品适量，置10 mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，制成质量浓度约为10 μg/mL的对照品溶液。

3 结果

3.1 加味左金丸中化合物的鉴定与分析

取供试品溶液和各药材溶液，按“2.1”项下的色谱与“2.2”项下的质谱条件，高分辨质谱测定，得到正、负离子模式下的总离子流图，见图1。通过质谱给出的分子离子峰和二级质谱碎片离子峰，结合对照品的相对保留时间，参考相关的文献，从加味左金丸中分离和鉴定出92个成分，包括16个有机酸类成分、34个黄酮类成分、17个生物碱类成分、21个萜类成分与4个其他类成分。其中14个来自枳壳、陈皮和青皮，11个来自甘草，14个来自白芍，6个来自香附，10个来自黄连，2个来自吴茱萸，11个来自黄芩，7个来自延胡索，5个来自木香，5个来自柴胡，6个来自当归，2个来自郁金，具体结果见表1。

3.2 有机酸类化合物

有机酸类是分子结构中含有羧基的化合物，在中草药的叶、根、特别是果实中广泛分布。方中的有机酸类化合物根据羧基相连的结构，主要分为脂肪族类有机酸和芳香族类有机酸。加味左金丸中共鉴定出16个有机酸，包括化合物1、4、5、7、10、12、13、18、45、63、68、73、77、78、82、91。由于结构中都含有羧基，因此质谱中的负离子模式的响应最好，二级质谱容易产生CO2，H2O等中性丢失。例如绿原酸的裂解规律，负离子模式可见其分子离子峰/353 [M－H]−，其特征碎片离子为/191、/179、/173、/161、/135，其中/191与/179是其酰氧键断裂产生的碎片，/191与/179的碎片峰丢失H2O形成/173、/161的碎片峰，/173的碎片峰丢失CO2形成/135的碎片峰，经与文献报道[33]对比，确定该化合物为绿原酸。例如没食子酸的质谱裂解规律，负离子模式可见其分子离子峰/169 [M－H]−，其特征碎片离子为/125、107、97，分别为分子离子峰丢失CO2、CO2与H2O、CO2与CO产生的裂解的碎片，经与文献报道[34]对比，确定该化合物为没食子酸。

图1 加味左金丸提取液的UPLC-Q-TOF/MS总离子流色谱图

表1 加味左金丸提取液中化合物的UPLC-Q-TOF/MS定性分析结果

Table 1 Qualitative analysis results of chemical constituents in Jiawei Zuojin Pill extracting solution by UPLC-Q-TOF/MS

峰号tR/min准分子离子峰分子式实测值(m/z)理论值(m/z)误差(×10−6)碎片离子化合物名称来源植物 10.65[M－H]−C7H12O6191.053 8191.054 5−3.66127.103 4, 109.044 1, 93.160 4奎宁酸陈皮、青皮、枳壳[17] 21.26[M＋H]+C27H30O15595.165 2595.165 9−1.18577.165 3, 433.117 3新西兰牡荆苷II甘草[18] 31.43[M＋H]+C27H30O14579.184 1579.184 7−1.04136.065 1野漆树苷陈皮、青皮、枳壳[17] 41.78[M－H]−C7H6O5169.013 3169.013 5−1.18125.023 2没食子酸白芍[19] 52.68[M－H]−C6H8O7191.019 6191.019 31.57173.008 3, 129.021 3柠檬酸白芍[19] 63.72[M－H]−C23H28O14S559.112 8559.112 30.89530.106 1, 397.074 5氧化芍药苷亚硫酸酯白芍[19] 74.31[M－H]−C9H10O3165.056 3165.055 54.85121.066 4, 119.050 1, 93.034 5对羟基苯丙酸甘草[20] 85.11[M＋H]+C23H28O12497.166 5497.165 71.61467.153 3, 359.127 4, 335.112 7氧化芍药苷白芍[19] 95.23[M＋H]+C23H28O11481.170 6481.170 30.62319.117 1, 301.107 5, 197.080 4芍药内酯苷白芍[20] 105.51[M－H]−C10H10O5209.046 2209.045 62.87165.056 6, 121.065 3对羟基苄基丙二酸甘草[20] 115.92[M＋H]+C15H23NO234.178 6234.177 40.85146.173 2rotundine B香附[21] 126.43[M－H]−C15H14O6289. 070 1289. 071 3−0.69271.060 6, 181.070 2儿茶素白芍[19] 136.91[M－H]−C16H18O9353.087 2353.086 51.98191.064 2, 179.043 1, 161.021 6绿原酸黄连[18] 147.88[M＋H]+[M－H]−C15H12O4257.080 6255.080 4257.080 9255.080 9−1.17−1.96147.044 1, 137.023 3, 135.009 22',4,4'-三羟基查耳酮甘草[20] 158.93[M＋H]+C18H13N3O288.114 1288.114 7−2.08273.089 8, 244.087 5217.076 9, 190.066 2吴茱萸次碱*吴茱萸[22-23] 1610.14[M－H]−C23H28O13S543.116 9543.117 3−0.74513.106 5, 381.075 3芍药苷亚硫酸酯白芍[19] 1711.05[M－H]−[M＋H]+C21H18O11445.085 2447.085 7445.084 9447.084 90.671.79269.046 3黄芩苷*黄芩[24] 1811.63[M＋H]+C16H24O8345.051 3344.047 11.98181.052 7, 161.065 8牡丹皮苷F白芍[19] 1912.02[M＋H]+C15H23NO234.178 2234.177 33.84216.173 5, 188.172 8, 160.162 6, 146.175 2(+)-β-rotunol香附[21] 2012.64[M＋H]+C20H17NO5352.116 5352.117 4−2.56337.091 4, 322.399 8, 308.088 9, 294.072 9氧化小檗碱黄连[25] 2113.42[M＋H]+C26H28O14565.154 7565.155 3−1.06433.114 2, 415.105 2夏佛托苷甘草[18] 2213.62[M＋H]+C17H18O6319.116 8319.117 8−3.13301.106 5, 197.080 6, 105.033 2, 77.039 3芍药内酯C白芍[20] 2313.78[M＋H]+C21H25NO4356.177 8356.178 5−1.97340.154 1, 308.128 4, 192.101 6, 177.078 1, 148.075 8异紫堇球碱延胡索[26] 2414.22[M＋H]+C20H19NO5354.125 3354.126 1−2.26336.123 2, 188.070 3, 149.059 4, 135.044 3原阿片碱延胡索[26] 2514.22[M＋H]+C21H25NO4356.178 8356.178 21.68178.086 5, 163.062 4, 151.057 6延胡索乙素*延胡索[26] 2614.51[M＋H]+C21H23NO5370.156 9370.157 4−1.35342.169 4, 295.069 1, 206.081 5隐品碱延胡索[26] 2714.73[M＋H]+C21H25NO4356.177 7356.178 2−1.40340.154 1, 310.119 5, 292.096 2海罂粟碱延胡索[26]

续表1

峰号tR/min准分子离子峰分子式实测值(m/z)理论值(m/z)误差(×10−6)碎片离子化合物名称来源植物 2815.33[M－H]−C26H28O13547.154 5547.153 12.56487.114 5, 457.107 2, 367.076 1, 337.069 4白杨素-6-C-阿拉伯糖- 8-C-葡萄糖苷黄芩[24] 2915.56[M＋H]+C23H28O11481.172 1481.171 21.87451.160 1, 359.135 9, 329.122 2芍药苷*白芍[19] 3015.76[M]+C20H24NO4342.169 1342.169 6−1.46297.115 2, 265.091 3木兰碱黄连[18] 3115.84[M－H]−[M＋H]+C21H18O11445.086 1447.083 9445.084 4447.084 43.82−1.12269.060 5, 225.040 3197.040 2去甲汉黄芩素-7-O- β-D-葡萄糖醛酸苷黄芩[24] 3217.17[M－H]−C36H58O10649.237 2649.236 21.54487.081 5长梗冬青苷陈皮、青皮、枳壳[17] 3318.41[M－H]−C27H32O15595.176 9595.177 6−1.18287.084 1, 151.039 5圣草枸杞苷陈皮、青皮、枳壳[17] 3418.72[M＋H]+C11H13NO3208.096 3208.096 8−2.40165.094 6, 150.073 2唐松草林碱黄连[18] 3518.91[M＋H]+C21H19NO4350.132 1350.131 12.86334.107 2, 320.091 4, 304.096 2, 290.081 7 二氢白屈菜红碱延胡索[26] 3619.13[M－H]−C27H32O15595.176 9595.177 8−1.51287.089 4, 151.160 1, 135.096 7新圣草枸杞苷陈皮、青皮、枳壳[17] 3719.65[M＋H]+C15H10O7303.049 2303.049 5−0.99257.043 1, 229.051 3槲皮素*甘草[18] 3820.21[M＋H]+C21H20O12465.103 8465.103 41.29303.051 5, 285.039 5, 257.044 3金丝桃苷白芍[19] 3920.66[M＋H]+C21H20O11449.107 3449.108 3−2.23287.055 4, 153.081 6,135.024 3山柰酚-3-O-葡萄糖苷*白芍[19] 4021.13[M＋H]+C15H12O4257.080 5257.080 8−1.17239.073 1, 137.027 2甘草素*甘草[18] 4121.24[M－H]−C27H32O14579.167 6579.168 7−1.90433.167 2, 271.090 6, 153.001 4柚皮苷*青皮、枳壳[17]，陈皮[21] 4221.38[M＋H]+C15H20O2233.153 1233.153 6−2.14215.143 2, 187.147 1, 159.116 5, 145.100 4, 131.084 1, 119.084 2, 105.069 5, 91.053 4, 81.069 6木香烃内酯*木香[27-28] 4321.86[M－H]−[M＋H]+C16H12O6299.063 8301.064 1299.063 3301.063 31.672.66286.038 15,7,4′-三羟基-8-甲氧基黄酮黄芩[24] 4422.41[M＋H]+C15H20O3249.148 6249.148 21.61231.138 3, 203.143 1, 213.125 1, 185.131 6, 157.099 4, 143.084 4珊塔玛内酯木香[28] 4522.48[M＋H]+C12H14O3207.101 7207.101 41.45137.059 2, 165.090 4乙酸丁香酚酯木香[28] 4622.56[M－H]−C27H32O14579.169 8579.168 71.90271.090 1, 151.001 7芸香柚皮苷青皮、枳壳[17]、陈皮[21] 4722.87[M＋H]+C15H22O2235.169 5235.169 21.28161.133 5木香酸木香[28] 4823.15[M＋H]+C15H18O2231.138 8231.138 22.60213.127 4, 195.116 2, 185.132 1, 180.093 2, 175.076 3, 165.069 3, 157.101 4, 143.085 2, 128.062 5去氢木香内酯*木香[27-28] 4923.54[M＋H]+C28H34O15611.173 9611.174 6−0.82449.119 2, 303.099 3, 195.096 1橙皮苷*青皮、枳壳[17]、陈皮[21] 5023.63[M－H]−C15H10O6285.040 9285.040 41.75199.040 5, 175.042 1, 151.005 3, 133.031 4木犀草素黄芩[29]

续表1

续表1

峰号tR/min准分子离子峰分子式实测值(m/z)理论值(m/z)误差(×10−6)碎片离子化合物名称来源植物 7833.22[M－H]−C18H30O2277.216 4277.217 2−2.89255.216 6, 248.217 3, 219.216 3, 206.216 2亚麻酸当归[30] 7933.38[M＋H]+C16H12O5285.075 1285.075 9−2.81270.052 8千层纸素A*黄芩[18] 8034.31[M－H]−C17H14O6313.072 6313.071 14.79298.049 6, 295.228 2, 283.024 6, 255.024 7, 164.982 5二羟基-二甲氧基黄酮黄芩[29] 8134.45[M＋H]+C15H24O2237.177 1237.177 3−0.84219.172 7, 201.175 1isocorymbolone香附[21] 8235.06[M－H]−C18H34O2281.248 6281.250 2−5.69255.252 2, 164.253 1, 130.241 1十八烯酸当归[30] 8335.22[M＋H]+C20H20O7373.121 5373.120 13.75357.128 3, 343.125 2, 329.123 8, 312.115 3甜橙黄酮青皮、枳壳、陈皮[21] 8435.43[M＋H]+C21H22O8403.119 9403.119 41.24388.105 4, 373.108 3, 355.089 0, 358.098 1, 330.006 7, 327.065 3川陈皮素青皮、枳壳[17]、陈皮[21] 8535.58[M－H]−C15H10O4253.050 8253.050 60.79209.063 3, 143.054 3, 63.039 1白杨素黄芩[29] 8636.14[M－H]−C28H34O14593.124 2593.124 10.17447.289 8, 285.082 6, 270.079 2枸橘苷*陈皮、青皮、枳壳[17] 8736.77[M＋H]+C15H24O2237.176 3237.176 4−0.42219.173 9, 201.174 6, 179.172 4cypersol B香附[21] 8836.98[M＋H]+C19H22O6343.109 7343.109 50.58327.103 3, 313.103 8, 299.105 1, 282.103 5黄芩配基甲醚青皮、枳壳、陈皮[21] 8937.35[M＋H]+C22H24O9433.141 4433.140 52.08418.142 9, 403.148 2, 385.143 63,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黄酮青皮、枳壳、陈皮[21] 9037.35[M＋H]+C15H22O219.167 2219.167 4−0.91201.163 3, 163.167 3, 145.165 1, 135.163 4香附烯酮香附[21] 9137.76[M＋H]+C16H22O4279.159 8279.159 22.15205.085 6, 149.023 8, 57.069 3邻苯二甲酸二丁酯白芍[20] 9237.76[M＋H]+C15H22O219.168 9219.168 42.28201.165 5, 163.168 1, 145.166 3, 135.167 2α-香附酮香附[21]

*该化合物是由对照品进行指认

*This compound was identified using reference standards

3.3 黄酮类化合物

黄酮类化合物广泛存在于自然界的植物中，是以黄酮（2-苯基色原酮）为母核而衍生的一类黄色色素，以C6-C3-C6为基本碳架的一系列化合物，在植物体内大部分与糖结合成苷类的形式存在，也有的以游离形式存在。根据三碳键（C3）结构的氧化程度和B环的连接位置等特点，黄酮类化合物可分为下列几类：黄酮和黄酮醇；黄烷酮（又称二氢黄酮）和黄烷酮醇（又称二氢黄酮醇）；异黄酮；异黄烷酮（又称二氢异黄酮）；查耳酮；二氢查耳酮；橙酮；黄烷和黄烷醇。糖基多连在C8或C6位置上，以氧苷为主，连接的糖有单糖（葡萄糖、半乳糖、鼠李糖等），双糖（槐糖、龙胆二糖、芸香糖等）、三糖（龙胆三糖、槐三糖等）与酰化糖（2-乙酰葡萄糖、吗啡酰葡萄糖等）。加味左金丸中共鉴定出黄酮共34个，其中黄酮苷元19个、黄酮苷15个。按母核的结构不同，包括黄酮20个、二氢黄酮10个、黄酮醇3个、查耳酮1个。黄酮类化合物在质谱中的裂解方式，主要有CO、CO2等中性离子丢失、丢失侧链基团，糖基的断裂，C环发生RDA裂解等。以二氢黄酮苷类成分柚皮苷为例，负离子模式可见其分子离子峰/579 [M－H]−，其特征碎片离子为/433、/271、/153，其中/433为准分子离子峰脱去鼠李糖得到的碎片峰，/271为碎片峰/433脱去1分子葡萄糖产生的，/153是碎片峰/271发生逆-狄尔斯-阿尔德反应（RDA）裂解，丢失/120中性碎片得到的，经与文献报道[35]对比，确定该化合物为柚皮苷。以黄酮类成分汉黄芩素为例，正离子模式可见其分子离子峰/285 [M＋H]+，负离子模式可见其分子离子峰/283 [M－H]−，其特征碎片离子为/268、/240、/239、/224，其中/268为准分子离子峰脱去甲基得到的碎片峰，/240为碎片峰/268脱去-CO得到的碎片峰，/240为碎片峰/268脱去-COH得到的碎片峰，/224为碎片峰/268脱去-COH得到的碎片峰，经与文献报道[24]对比，确定该化合物为汉黄芩素，其二级质谱图见图2，可能的裂解途径见图3。

3.4 生物碱类化合物

生物碱是存在于自然界中的一类含氮的碱性有机化合物，有显著的生物活性，是中草药中重要的有效成分之一。加味左金丸中鉴定得到17个生物碱类成分，主要来在于黄连、吴茱萸和延胡索。生物碱的类型主要为异喹啉类生物碱和吲哚类生物碱，异喹啉类生物碱主要来自于黄连和延胡索，如表小檗碱、小檗碱、氧化小檗碱、巴马汀等；吲哚类生物碱主要来自于吴茱萸，如吴茱萸次碱和吴茱萸碱。以异喹啉类生物碱原小檗碱型的小檗碱举例，正离子模式下的分子离子峰为/336 [M]+，其特征碎片离子为/321、/320、/292，其中/320为准分子离子峰失去端基上的甲基并发生氢重排得到的碎片峰，/292为碎片峰/320脱去-CO产生的，经与文献报道[35]对比，进一步对比对照品确定该化合物为小檗碱。以异喹啉类生物碱氧化小檗碱型的氧化小檗碱举例，正离子模式下的分子离子峰为/352 [M＋H]+，其特征碎片离子为/337、/322、/308、/294，其中/337为准分子离子峰失去甲基得到的碎片峰，其中/322为/337碎片峰失去端基上的甲基并发生氢重排得到的碎片峰，/308为/337碎片峰失去-CHO得到的碎片峰，/294为/308碎片峰失去甲基得到的碎片峰，经与文献报道[25]对比，确定该化合物为氧化小檗碱，其二级质谱图见图4，可能的裂解途径见图5。以吲哚类生物碱的吴茱萸次碱举例，正离子模式下的分子离子峰为/288 [M＋H]+，其特征碎片离子为/273、244、217、190，其中/273为准分子离子峰失去-CH3得到的碎片峰，其中/244为/273碎片峰丢失-HCO的碎片峰，/217为/244碎片峰失去-HCN得到的碎片峰，/190为/217碎片峰失去-HCN得到的碎片峰，经与文献报道[23]对比，进一步对比对照品确定该化合物为吴茱萸次碱，其二级质谱图见图6，可能的裂解途径见图7。

图2 汉黄芩素的MS/MS图

图3 汉黄芩素可能的裂解途径

图4 氧化小檗碱的MS/MS图

图5 氧化小檗碱可能的裂解途径

3.5 萜类化合物

萜类化合物是由甲戊二羟酸衍生、且分子骨架以异戊二烯单元（C5单元）为基本结构单元的化合物及其衍生物，在自然界中，萜类化合物分布很广，有些具有生理活性。根据分子中包括异戊二烯单位的数目将萜类可分为单萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜、多萜。加味左金丸中鉴定得到21个萜类成分，有倍半萜类、倍半萜内酯类、单萜类和三萜类。倍半萜类化合物有α-香附酮、香附烯酮、石竹烯氧化物、isocorymbolone、cypersol B；倍半萜内酯类化合物有去氢木香烃内酯、木香烃内酯、珊塔玛内酯、木香酸；单萜类化合物主要来自于白芍，有氧化芍药苷亚硫酸酯、氧化芍药苷、芍药苷亚硫酸酯、芍药苷、芍药内酯苷、芍药内酯C；三萜类化合物主要来自于柴胡，有柴胡皂苷 D、柴胡皂苷 A、柴胡皂苷C、4″--乙酰基柴胡皂苷D、柴胡皂苷G、长梗冬青苷。以倍半萜内酯类化合物去氢木香烃内酯举例，正离子模式下的分子离子峰为/231 [M＋H]+，其特征碎片离子为/213、195、185、180、175、165、157、143、128，其中/213为准分子离子峰失去1分子H2O得到的碎片峰，其中/195为准分子离子峰失去2分子H2O得到的碎片峰，其中/185为/213碎片峰失去CO得到的碎片峰，经与文献报道[28]对比，确定该化合物为去氢木香烃内酯。以三萜皂苷类化合物柴胡皂苷G举例，负离子模式下的分子离子峰为/779 [M－H]−，根据精确相对分子质量可确定其分子式为C42H68O13，其特征碎片离子为/617、471，其中/617为母离子峰失去1分子半乳糖得到的碎片峰，其中/471为/617碎片峰失去1分子的葡萄糖得到的碎片峰，经与文献报道[29]对比，确定该化合物为柴胡皂苷G。

图6 吴茱萸次碱的MS/MS图

图7 吴茱萸次碱可能的裂解途径

3.6 指纹图谱的建立

3.6.1 色谱条件 指纹图谱的色谱条件为：色谱柱为Atlantis T3 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相A为乙腈，流动相B为0.05%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～5 min，5% A；5～40 min，5%～40% A；40～60 min，40%～60% A；60～90 min，60%～80% A；90～94 min，80%～5% A；94～104 min，5% A；体积流量为1.0 mL/min；检测波长220 nm；柱温40 ℃；进样量10 μL。液相色谱图见图8。

3.6.2 精密度试验 取同一批次（1903226）的样品，按“2.3.1”项方法制备成供试品溶液，作为精密度试验溶液，按“3.6.1”项下的色谱条件，供试品溶液连续进样6次测定。由于12号峰（橙皮苷）面积最大，同时分离度符合要求，因此选择此峰为参照峰。以12号峰为参照峰，计算13个共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.0%，相对峰面积的RSD均小于4.0%，表明方法的精密度良好。

3.6.3 重复性试验 取同一批次（1903226）的样品，精密称取6份，按“2.3.1”项方法制备成供试品溶液，作为重复性试验溶液，按“3.6.1”项下的色谱条件，进样测定。以12号峰为参照峰，计算13个共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.0%，相对峰面积的RSD均小于4.0%，表明该检测方法重复性良好。

3.6.4 稳定性试验 按“2.3.1”项方法制备成供试品溶液，作为稳定性试验溶液，按“3.6.1”项下的色谱条件，分别在0、2、4、6、8、12、16、18、24、36、48 h进行测定。以12号峰为参照峰，计算13个共有峰的相对保留时间与相对峰面积。结果显示，各共有峰相对保留时间的RSD均小于2.0%，相对峰面积的RSD均小于4.0%，表明48 h内供试品溶液的稳定性良好。

3.6.5 指纹图谱的建立及相似度评价 将15批加味左金丸按“2.3.1”项方法制成供试品溶液，按“3.6.1”项指纹图谱的色谱条件对其进行检测，记录色谱图，数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，以S1号样品的色谱图为参照图谱进行全谱峰匹配，经过与对照品比对，指认了13个共有峰，1号峰为黄芩苷、2号峰为山柰酚-3--葡萄糖苷、3号峰为槲皮素、4号峰为汉黄芩素、5号峰为甘草素、6号峰为千层纸素A、7号峰为芍药苷、8号峰为吴茱萸次碱、9号峰为小檗碱、10号峰为巴马汀、11号峰为枸橘苷、12号峰为橙皮苷、13号峰为柴胡皂苷d。15批加味左金丸样品的指纹叠加图谱，见图9，各批样品与对照图谱的相似度分别为0.972、0.977、0.979、0.981、0.991、0.984、0.992、0.991、0.992、0.985、0.982、0.984、0.990、0.979、0.988。结果显示，15批加味左金丸与对照谱图的相似度均在0.95以上，这表明15批次加味左金丸质量的稳定性和均一性良好。

1-黄芩苷 2-山柰酚-3-O-葡萄糖苷 3-槲皮素 4-汉黄芩素 5-甘草素 6-千层纸素 A 7-芍药苷 8-吴茱萸次碱 9-小檗碱 10-巴马汀 11-枸橘苷 12-橙皮苷 13-柴胡皂苷d

4 讨论

为了对加味左金丸的物质基础进行深入的研究，本研究采用具有强大分离鉴定能力的高分辨质谱技术对于加味左金丸的化学成分进行系统分析。实验中供试品的提取方式采用药典中的方法，但是本研究对于提取溶剂和提取时间也进一步进行了确认，因为处理过程中溶剂会有变化和时间也会产生误差，因此分别考察了该样品处理方式的耐用性范围。本研究主要对于色谱条件和质谱条件进行了较为系统、全面的优化，以便提高质谱的分离鉴定能力。首先对于色谱条件进行了优化，在流动相考察中，分别考察了乙腈水溶液、甲醇水溶液、甲醇乙腈水溶液、乙腈甲酸水溶液、甲醇甲酸水溶液、乙腈乙酸铵水溶液，甲醇乙酸水溶液，综合分离度和分离的峰个数确定了乙腈甲醇甲酸水溶液体系。在色谱柱考察中，不仅仅对于不同厂家的C18柱进行了考察，而且对于其他类型的填料也进行了考察，由于是UPLC体系，体积流量不能太高，样品必须进行滤过，进样量也要进行优化，以免超载进样。其次对于质谱条件进行了优化，由于中成药中成分较为复杂，有些酸性成分在负离子模式的响应更好，因此采用了正、负离子模式同时进行采样，同时对于二级质谱的碰撞能量进行了优化，以便得到更多的碎片峰信息，有利于质谱数据解析。

图9 15批加味左金丸指纹图谱

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技术共鉴定了92个化学成分，主要包括16个有机酸类成分、34个黄酮类成分、17个生物碱类成分、21个萜类成分与4个其他类成分。加味左金丸具有平肝降逆、疏郁止痛的功效，研究证明复方中君药黄连中的生物碱具有抗氧化和消炎的作用[36-37]，复方中君药吴茱萸中的生物碱具有镇痛、镇静安神的作用[38]，臣药黄芩中的黄酮具有抗菌、抗炎、免疫调节、镇静和解热的作用[39]。加味左金丸中多个成分共同发挥作用，使其临床广泛用于胃炎、食管炎与慢性结肠炎等疾病的治疗。基于化学成分的研究，为了更好地控制该中成药的质量，本实验建立了该中成药的液相指纹图谱，对于多批次的样品进行了测定，也通过数据表明样品质量的稳定性。

本研究首次对加味左金丸中多种化学成分进行了系统的分离和鉴定，基本阐明了该中成药中的化学成分的种类，并对各个成分进行了药材来源的归属，为加味左金丸的药效的基础研究提供参考。当然，在整个研究过程中，有一些化学成分还未鉴定，需要后续做进一步的研究。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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Chemical components and chromatographic fingerprints of Jiawei Zuojin Pill based on UPLC-Q-TOF/MS

CHEN Hui-peng1, WANG Yin1, YU Hui-min2, ZHOU Hong-zu3

1. Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Shenzhen 518116, China 2. School of Medicine, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China 3. Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital, Shenzhen 518033, China

To qualitatively analyze the main chemical constituents of traditional Chinese medicine compound Jiawei Zuojin Pill (加味左金丸) by using UPLC-Q-TOF/MS technology.The separation was performed on ACQUITY Premier BEH C18column (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm), and the gradient elution of acetonitrile-methanol-0.1% formic acid was used as mobile phase at a flow rate of 0.3 mL/min. The data was collected by the positive and negative ion modes using Q-TOF/MS and ESI source. The main chemical constituents of Jiawei Zuojin Pill were identified according to the exact molecular mass, the cleavage fragments of MS/MS, the literature data, and the reference control. And chromatographic fingerprints of different batches of Jiawei Zuojin Pill were established.A total of 92 chemical components were identified in Jiawei Zuojin Pill, including 16 organic acids, 34 flavonoids, 17 alkaloids, 21 terpenoid and four other components. The HPLC fingerprint of Jiawei Zuojin Pill was established with 13 common peaks, which were baicalin, astragalin, quercetin, wogonin, liquiritigenin, oroxylin A, paeoniflorin, rutecarpine, berberine, palmatine, poncirin, hesperidin, saikosaponin d. And the precision, stability and reproducibility of the HPLC fingerprint were acceptable. The components in different batches of Jiawei Zuojin Pill were basically similar.This study showed that UPLC-Q-TOF/MS technology provided a rapid and accurate method for the identification of chemical constituents in Jiawei Zuojin Pill. The HPLC fingerprint could provide an important basis for the quality control and pharmacodynamic material basis study of Jiawei Zuojin Pill.

HPLC-MS; Jiawei Zuojin Pill; fragmentation patterns; fingerprint; baicalin; astragalin; wogonin; liquiritigenin; oroxylin A; paeoniflorin; rutecarpine; berberine;saikosaponin d

R284.1

A

0253 - 2670(2023)14 - 4442 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.14.005

2023-01-19

深圳市基础研究专项（自然科学基金）基础研究面上项目（JCYJ20220531102208019）；2022年深圳市药学会医院药学研究基金（恒瑞基金）（SZ2022A25）；深圳大学聚徒＋创研项目（2022年度）

陈会朋（1988—），男，主管中药师，研究方向为中药复方研究。Tel: 13410898605 E-mail: 372677278@qq.com

余惠旻，男，博士，副研究员，主要从事中药及其复方的现代药理研究。E-mail: yuhuimin@szu.edu.cn

周红祖，女，主任中药师，中药特色技术传承人（粤中医办函[2016]54号），主要从事中药学基础及中药药理、鉴定研究。E-mail: zhouhzu@163.com

[责任编辑 王文倩]