高效液相色谱法测定化妆品中对羟基苯乙酮、对茴香酸和辛酰羟肟酸

王继双，李莉，王海燕，许鸣镝

（中国食品药品检定研究院，北京 100050）

化妆品原料品种繁多，营养丰富，易受到微生物的污染，导致产品腐败变质，因此，化妆品中需要添加防腐剂。防腐剂主要通过干扰微生物细胞中的代谢酶、核酸和蛋白质等的合成，抑制微生物的生长，从而起到防腐的作用[1‒2]。

传统的防腐剂主要有尼泊金酯类、苯氧乙醇、卡松系列、甲醛释放体等。随着研究的深入和安全评估数据的积累，一些传统防腐剂的安全问题受到越来越多的关注，如尼泊金酯类具有潜在的内分泌干扰特性，卡松类会引起皮肤接触性皮炎，甲醛释放体为致癌物对粘膜有刺激性等[3‒4]，因此人们开始寻找其它的防腐体系。

对羟基苯乙酮(C8H8O2)又名4-羟基苯乙酮，是一种天然植物提取物，能在较大的pH 值、温度范围内保持稳定性，具有抗氧化、抗刺激、增强防腐的作用。有报道称对羟基苯乙酮对眼睛、呼吸道和皮肤会产生一定的刺激作用[5‒6]。

对茴香酸即对甲氧基苯甲酸，又名P-茴香酸、大茴香酸、茴香酸，来源于天然物质茴香油和茴香菜，是一种有机酸，不属于防腐剂，但有较好的防腐效果，常作为香料和防腐助剂出现在化妆品配方中[7]。

辛酰羟肟酸，又名辛酰异羟肟酸、辛基羟肟酸、N-羟基正辛酰胺，是一种有机酸，对金属离子有较强的螯合作用，能够高效螯合铁离子，使霉菌在铁离子缺乏的环境中生长受到抑制，从而防止化妆品变质，延长保质期[1,8]。辛酰羟肟酸无急性毒性、亚慢性毒性、发育和生殖毒性等。目前除澳大利亚、韩国对辛酰羟肟酸有最大使用浓度(质量分数)不超过0.3%的规定外，其它国家暂无使用限制说明[9‒10]。

对羟基苯乙酮、对茴香酸和辛酰羟肟酸收录在《已使用化妆品原料名称目录》(2015 年版)中，但不在《化妆品安全技术规范》(2015年版)的可用防腐剂列表中，不属于防腐剂，常作为防腐助剂使用，属于替代防腐剂。由于一些传统防腐剂存在安全隐患，越来越多的化妆品生产商开始使用替代防腐剂，一些声称“不含防腐剂”的产品中，大多是添加了替代防腐剂。目前，对羟基苯乙酮、对茴香酸和辛酰羟肟酸无使用范围和使用限量的规定，相关检测方法也未建立，处于监管盲区，因此建立快速、准确、简便的检测方法对监督管理化妆品市场中对羟基苯乙酮、对茴香酸和辛酰羟肟酸有重要的意义。

化妆品中对羟基苯乙酮的检测方法主要有高效液相色谱法[11-13,6]和高效液相色谱-质谱法[14]。对茴香酸的检测方法主要有高效液相色谱法[15]。辛酰羟肟酸的检测方法主要有高效液相色谱法[1,9,16]和超高效液相色谱-串联质谱法[4]。目前报道多种防腐剂同时检测的文献中多包含对羟基苯乙酮、对茴香酸和辛酰羟肟酸中的一种或两种[5,9,11,15]，同时包含三种的尚未见报道。笔者建立了同时测定化妆品中对羟基苯乙酮、对茴香酸和辛酰羟肟酸含量的高效液相色谱法，可为对羟基苯乙酮、对茴香酸和辛酰羟肟酸的风险评估和监督管理提供技术支持。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1260VL型，美国安捷伦科技有限公司。

电子天平：AX205型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

涡旋振荡器：Vortex-5型，江苏省海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

超声波清洗器：KQ 700DE型，昆山市超声仪器有限公司。

超纯水系统：Advance RO+Pro VF型，德国赛多利斯公司。

对羟基苯乙酮对照品：纯度(质量分数)为99.0%，广州佳途科技股份有限公司。

对茴香酸对照品：纯度(质量分数)大于99.0%，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司。

辛酰羟肟酸对照品：纯度(质量分数)为98.8%，广州佳途科技股份有限公司。

甲醇和乙腈：均为色谱纯，德国默克公司。

磷酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

化妆品样品：包括爽肤水、面膜、凝胶和面霜，均购自电商平台。

实验用水为超纯水，符合GB/T 6682—2008 一级水要求。

1.2 色谱条件

色谱柱：Osaka Soda Capcell Pak MG C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本大阪曹達株式会社)；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL；检测波长：210 nm；流动相：A相为水(含质量分数为0.1%的磷酸)，B相为乙腈，梯度洗脱，0～20 min A 体积分数由90%降至50%，20～21 min，A 体积分数由50%降至10%，21～23 min，A 体积分数保持10%，23～23.5 min，A 体积分数由10%上升至90%，23.5～26 min，A 体积分数保持90%，流量为1.0 mL/min。

1.3 实验步骤

1.3.1 溶液配制

单一标准储备溶液：分别精密称取对羟基苯乙酮、对茴香酸和辛酰羟肟酸对照品10 mg 于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至标线，配制成1 000 mg/L的单一标准储备溶液。

混合标准溶液：取对羟基苯乙酮标准储备溶液、对茴香酸标准储备溶液和辛酰羟肟酸标准储备溶液各1 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至标线，配制成质量浓度均为100 mg/L的混合标准溶液。

系列混合标准溶液：用甲醇将上述混合标准溶液逐级稀释，配制成对羟基苯乙酮、对茴香酸和辛酰羟肟酸的质量浓度均分别为2.5、5、10、20、40、60 mg/L的系列混合标准溶液。

样品溶液：精密称取化妆品样品1.0 g (精确至0.000 1 g)于10 mL 具塞比色管中，用80%甲醇溶液定容至标线，振荡30 s，超声提取10 min，冷却至室温，取上清液，以0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，作为样品溶液。

1.3.2 测定方法

取样品溶液，在1.2色谱条件下测定。以色谱峰面积标准曲线法定量。

2 结果与讨论

2.1 检测波长选择

在1.2色谱条件下，在210～400 nm波长范围内扫描3 种物质的混合标准溶液，吸收光谱如图1 所示。结果显示，对羟基苯乙酮在220、275 nm附近有较强的紫外吸收，对茴香酸在210、255 nm附近有较强的紫外吸收，辛酰羟肟酸在210 nm附近有较强的紫外吸收。在不影响灵敏度的前提下，为了便于检测，选择3种物质的检测波长为210 nm。

图1 对羟基苯乙酮、对茴香酸及辛酰羟肟酸紫外吸收光谱图

2.2 流动相选择

参考文献[1,5,11]，试验考察了0.1%(体积分数，下同)甲酸溶液-乙腈、0.1%(体积分数，下同)乙酸溶液-乙腈、0.1%(体积分数，下同)磷酸溶液-乙腈3种流动相体系对加标样品溶液(对羟基苯乙酮、对茴香酸和辛酰羟肟酸的加标质量浓度均为50 mg/L)中3种目标物的分离效果和色谱峰形，色谱图如图2 所示。结果表明，3种流动相体系均能有效分离3种目标化合物，而使用0.1%甲酸溶液-乙腈和0.1%乙酸溶液-乙腈的流动相体系会导致系统基线不稳，因此选择0.1%磷酸溶液-乙腈作为流动相。

图2 不同流动相下加标样品溶液色谱图

2.3 色谱柱的选择

试验考察了Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Dikma DIAMONSIL C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Osaka Soda Capcell Pak MG C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)3种色谱柱对加标样品溶液(对羟基苯乙酮、对茴香酸和辛酰羟肟酸的加标量均为50 mg/L)中3 种目标物的分离效果。3 种色谱柱的色谱分离参数见表1。结果表明，3种色谱柱均能有效分离目标物，与Agilent ZORBAX SB-C18柱和Dikma DIAMONSIL C18柱相比，Osaka Soda Capcell Pak MG C18色谱柱的分离度更好，柱效更高，且色谱峰形更加对称，因此选用Osaka Soda Capcell Pak MG C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)作为分离色谱柱。图3为混合标准溶液、空白样品溶液、加标样品溶液色谱图。

表1 不同色谱柱色谱分离参数

图3 混合标准溶液、空白样品溶液及加标样品溶液色谱图

2.4 提取条件的选择

分别以体积分数为60%、70%、80%、90%、100%的甲醇溶液为提取剂，考察不同超声时间(10、20、30、40 min)下3种目标物的色谱峰面积，相对峰面积越大表明提取效果越好，结果如图4所示。结果表明，对茴香酸和辛酰羟肟酸以80%的甲醇溶液超声提取10 min提取效果最好，对羟基苯乙酮以100%的甲醇溶液超声提取10 min提取效果最好，以80%的甲醇溶液超声提取10 min提取效果次之。综合考虑，3种目标物的提取条件为80%甲醇溶液超声提取10 min。

图4 不同提取试剂、超声时间下目标物提取率

2.5 线性方程与检出限

在设定的色谱条件下，测定对羟基苯乙酮、对茴香酸和辛酰羟肟酸系列混合标准溶液，以3 种物质的质量浓度为横坐标，对应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性方程和相关系数。取质量浓度为2.5 mg/L的混合标准溶液，用甲醇逐级稀释，在1.2色谱条件下测定，以信噪比为3∶1对应的质量浓度作为检出限。3 种目标物质量浓度线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表2。结果表明，对羟基苯乙酮、对茴香酸和辛酰羟肟酸质量浓度在2.5～60 mg/L范围内，与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均不小于0.999 8。

表2 质量浓度线性范围、线性方程、相关系数及检出限

2.6 加标回收与精密度试验

按照实验方法分别对爽肤水、面膜、凝胶、面霜4 种基质的空白样品进行3 个浓度水平的加标回收试验，每个浓度水平重复6次，计算回收率和测定值的相对标准偏差，结果见表3。由表3 数据可知，目标物低、中、高三个水平的加标回收率为85.8%～111.1%，测定结果的相对标准偏差均不大于5.9%。

表3 精密度和回收试验结果(n=6)

3 结语

建立了高效液相色谱法同时测定化妆品中对羟基苯乙酮、对茴香酸和辛酰羟肟酸含量的分析方法。该方法样品处理简单，灵敏度高，准确性好，可用于化妆品中对羟基苯乙酮、对茴香酸和辛酰羟肟酸的同时测定。