超声辅助热酸提取液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法测定香辛料中6种砷形态

曹璨，吴志刚

（辽宁省重要技术创新与研发基地建设工程中心，辽宁省分析科学研究院，沈阳 110015）

香辛料是指具有天然味道或气味的植物特定部位[1]，如种子、果实、根、树皮等制成的调味料，可单独使用也可多种成分混合使用，用以改善食物的口感和味道，是人们烹饪和食品生产加工中不可或缺的材料。香辛料应用广泛，大多数作为药食两用的植物，具有一定药理作用[2]；香辛料提取物还因具有抗氧化活性和抑菌防腐的作用[3]而应用于食品保鲜。随着环境污染的日益严重，土壤、水体、空气等污染情况对作物影响明显，特别是作物对有毒有害元素有富集作用，同时加工和提取环节也增加了有害元素污染的几率，增加食品安全风险，其中砷元素因毒性较强受到普遍关注。

砷摄入量或身体蓄积量过高会导致皮肤损伤、神经损害、器官衰竭等，而砷元素在不同生物体中的存在形态各有不同，现已知不同砷形态中，毒性由大到小依次为亚砷酸盐、砷酸盐、一甲基砷、二甲基砷、砷胆碱、砷甜菜碱，其中亚砷酸盐和砷酸盐为无机砷，一甲基砷、二甲基砷、砷胆碱、砷甜菜碱以及各类砷糖、砷脂为有机砷，砷甜菜碱、砷糖和砷脂毒性很小[4]。因此仅以食品中总砷的含量作为评价指标，不足以体现食品中砷的毒性，砷形态分析能够更准确地反映食品安全风险。《食品安全国家标准 食品中污染物限量》(GB 2762—2022)[5]中谷物、水产、食用菌、调味品等均有部分品类以无机砷作限量要求，复合调味料中无机砷限量为0.1 mg/kg，香辛料作为复合调味料的主要原料，其总砷含量平均值远超过国家标准限量。目前香辛料相关研究主要集中在总砷含量测定[2,6]，而无机砷含量研究报道则很少，仅有田雨等[7]研究了桂皮中4种砷形态。

砷形态提取和砷形态检测是砷形态分析必不可少的两个部分，样品基质不同，采用的提取方式差异很大。《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》[8]主要针对大米、水产动物、婴幼儿辅助食品等，香辛料中含有大量挥发油和色素等，食品分析方法提取易干扰测定。田雨[7]等采用水-甲醇(1∶1，体积比，下同)溶液提取，液相色谱-原子荧光光谱(LCAFS)法分析，该提取方法需要去除甲醇，较为繁琐且周期长，LC-AFS 法需要将砷不同形态转化为气态氢化物才能够被检测器检测，而砷甜菜碱和砷胆碱等大分子需要紫外在线消解才能检测，且同时在线检测6种砷形态尚有一定难度[9]。液相色谱-电感耦合等离子体质谱(LC-ICP-MS)联用法对砷形态提取方式和提取剂的要求接受性广泛，目前被普遍应用[10‒11]。

笔者采用超声辅助热酸提取、LC-ICP-MS法检测，分析了香辛料中亚砷酸盐、砷酸盐、一甲基砷、二甲基砷、砷胆碱和砷甜菜碱6种砷元素形态，为香辛料食品安全风险评估提供方法参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用仪：Agilent1260-Agilent7700x 型，配有MassHunter 色谱-质谱联用工作站，美国安捷伦科技有限公司。

微波消解仪：Mars6 型，配有电热赶酸器，美国CEM公司。

多功能数字超声波水浴仪：DCS-250H型，辅光精密仪器(上海)有限公司。

高速冷冻离心机：CT14RD型，上海天美生化仪器公司。

电子分析天平：MS105DU 型，感量为0.01 mg和0.1 mg，瑞士梅特勒托利多公司。

纯水仪：Milli-Q型，德国默克公司。

砷形态溶液标准物质：(1)亚砷酸盐，标准物质编号为GBW 08666，标准值为(75.7±1.2) µg/g；(2)砷酸盐，标准物质编号为GBW 08667，标准值为(17.5±0.4) µg/g；(3)一甲基砷，标准物质编号为GBW 08668，标准值为(25.1±0.8) µg/g；(4)二甲基砷，标准物质编号为GBW 08669，标准值为(52.9±1.8) µg/g；(5)砷甜菜碱，标准物质编号为GBW 08670，标准值为(38.8±1.1) µg/g；(6)砷胆碱，标准物质编号为GBW 08671，标准值为(28.0±1.1) µg/g。中国计量科学研究院。

总砷溶液标准物质：标准物质编号为GBW 08611，标准值为1 000 mg/L，中国计量科学研究院。

内标混合溶液：含Li、Sc、Ge、Lu、Rh、Tb、Bi，各元素质量浓度均为100 mg/L，美国安捷伦科技有限公司。

混合调谐液：含Li、Co、Y、Ce、Tl，各元素质量浓度均为1 μg/L，美国安捷伦科技有限公司。

磷酸二氢铵、氨水：均为分析纯，中国医药集团有限公司。

硝酸、30%过氧化氢：均为优级纯，中国医药集团有限公司。

乙醇：色谱纯，上海沃凯化学试剂公司。

液氩：沈阳气体制造有限公司。

高纯氦气：纯度大于99.999% (体积分数)，沈阳气体制造有限公司。

实验室用水均为一级水，由Milli-Q制备。

茴香、草果、胡椒、肉蔻、辣椒样品：抽检样品。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱仪

色谱柱：PRP-X100 型阴离子柱(250 mm×4.1 mm，10 μm，瑞士哈美顿公司)；预处理柱：PRPX100 柱(25 mm×2.3 mm，瑞士哈美顿公司)；流动相：25 mmol/L NH4H2PO4-乙醇(99∶1)溶液(用氨水调至pH 为6.7)[11]，过0.45 µm 滤膜后超声脱气30 min，流量为1.0 mL/min，等度洗脱10 min；进样体积：20 µL。

1.2.2 质谱仪

载气：氩气，流量为1.08 L/min；补偿气：氩气，流量为0.3 L/min；等离子气：氩气，流量为15 L/min；等离子气：氩气，流量为0.9 L/min；氦气流量：4.1 mL/min (总砷)；采样深度：8 mm；雾化室温度：2 ℃；QP 偏转电压：-2.9 V；调谐模式：He 碰撞(总砷)，Nogas (砷形态)；分析模式：常规(总砷)，高灵敏度(砷形态)；积分时间：0.3 s (总砷)，0.5 s (砷形态)；氧化物比率：1.02%；双电荷比率：1.43%。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液配制

总砷系列标准溶液：准确量取一定体积的总砷溶液标准物质，用2%(质量分数，下同)硝酸溶液逐级稀释，配制成质量浓度分别为0、1.0、5.0、20.0、60.0、100.0 µg/L的总砷系列标准溶液。

6 种砷形态混合标准中间液：分别准确量取一定体积的6种砷形态溶液标准物质，用1%硝酸溶液逐级稀释，配制成6 种砷形态质量浓度均为1.00 mg/L的混合标准中间液。

6 种砷形态系列混合标准溶液：准确量取一定体积的6种砷形态混合标准中间液，用1%硝酸溶液配制成质量浓度为0、1.0、10.0、20.0、60.0、100.0µg/L的砷形态系列混合标准溶液。

1.3.2 样品预处理

香辛料样品用水冲洗干净，再用去离子水反复清洗，置于洁净室自然晾干后，用粉碎机粉成粉末，并过0.18 mm (80目)筛，待用。

测定总砷的样品预处理方法参考国家标准中总砷的测定方法[8]进行优化，准确称取样品0.5 g 于微波消解内管中，加入硝酸5 mL，于80 ℃电热赶酸器中预热10 min，加入1 mL 30%过氧化氢溶液，微波消解程序见表1。自动冷却至37 ℃以下，电热赶酸器温度设定为180 ℃，剩余溶液量约为1 mL，用超纯水转移并定容至100 mL。同时做试剂空白。

表1 微波消解程序

测定砷形态的样品预处理方法，准确称取样品1 g于50 mL离心管中，加入1%硝酸溶液20 mL，加盖留少许缝隙，于80 ℃水浴中超声提取10 min，提取完成后冷却至室温，离心15 min (4 ℃，9 000 r/min)，离心后用C18固相萃取柱和0.22 µm有机滤膜纯化上清液。同时做试剂空白。

测定提取态总砷的样品预处理方法，将测定砷形态的待测液和空白溶液分别移取10 mL，按测定总砷的预处理方法处理。

1.3.3 样品测定

总砷和提取态总砷测定时，设定蠕动泵速度为0.1 r/s，通过三通进样阀在线加入内标溶液，分别测定标准溶液序列和样品溶液序列。

砷形态测定时，将色谱柱通过peek管与雾化器连接，流出液不经过三通直接导入雾化器。分别测定标准溶液序列和样品溶液序列。设定蠕动泵速度为0.3 r/s，主要用于排除废液。

1.3.4 数据处理

采用外标法建立砷元素质量分数与离子计数间的定量关系，应用WPS office 2019进行实验数据统计和计算，应用OriginPro 2021进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 样品预处理条件优化

（1）提取液。测定砷形态常用的提取液有甲醇-水混合溶液[7]、稀酸溶液[12]、与流动相组成一致的提取液如磷酸盐缓冲溶液或碳酸盐缓冲溶液[13‒14]等，以流动相作为提取液，配制过程中pH调节等步骤较多；用甲醇-水混合溶液提取后，因甲醇含量过高容易造成ICP-MS 仪器锥孔的积碳和焰炬不稳，需要氮吹挥干[15]，所需时间较长，且容易引入二次污染，因此笔者选择稀酸溶液提取。常用的稀酸如硝酸、盐酸和乙酸等，盐酸中大量的35Cl 容易与等离子气中大量的40Ar 形成40Ar35Cl，对砷元素唯一的质量数75As产生强烈的质谱干扰，应避免使用；乙酸氧化性较弱，更容易保持各形态的稳定性；硝酸氧化性较强，需防止砷形态被氧化，质量分数不宜过高。因此分别以1%、2%、5%的乙酸溶液和0.5%、1%、2%的硝酸溶液作为提取液质量分数进行考察。

（2）提取温度。乙酸挥发性较高，提取温度不宜过高，以不超过60 ℃为宜，但温度过低则降低提取速率。分别设定提取温度为37、50、60 ℃；硝酸提取温度过高，容易改变砷元素形态，分别设定提取温度为70、80、90 ℃进行考察。

（3）提取方式。稀酸溶液提取常用的提取方式如烘箱热提取、水浴振荡热提取、超声辅助提取和微波辅助提取等，其中微波提取提取率优于水浴振荡提取[11]，且提取周期明显缩短。分别选择烘箱热提取、超声辅助提取和微波辅助提取作为提取方式进行考察。

以肉蔻样品为代表，按乙酸和硝酸不同提取剂分别建立3 因素3 水平正交试验L9(33)，按提取率(提取态总砷含量与总砷含量的比值)综合考察，提取条件正交试验结果见表2，统计结果见表3。

表2 乙酸和硝酸提取条件正交试验L9(33)结果

表3 乙酸和硝酸提取条件正交试验L9(33)统计结果

由表3 结果可知，乙酸提取率最高的组合应为A3B3C3，硝酸提取率最高的组合应为a2b2c2和a2b2c3。分别按最优条件进行实验，提取率分别为90.2%、98.9%和99.1%，且提取形态保持稳定，但乙酸提取效率低于硝酸提取，因此确定提取条件为1%硝酸在80 ℃超声提取和微波提取。

不同的提取方式提取速率不同，烘箱加热提取时间明显长于其它两种提取方式，由于不同提取方法提取时间差异很大，无法作为同一因素的不同水平进行正交试验。以上试验参考了文献中的提取时间，即无机砷烘箱加热提取2.5 h[8]、超声提取40 min[16]和微波提取10 min[11]，得到最优条件后再单独考察提取时间。

（4）提取时间。两种提取方式所选择的提取时间和对应的提取率见表4。

表4 提取时间条件选择测定结果

结果表明，两种提取方式都随着提取时长的增加，提取率逐渐提高，至10 min后变化不显著，两种提取方式的提取率没有显著性差异(p＜0.05)。因微波消解管不能直接离心，需要转移和重新配重，增加实验步骤和二次污染概率，因此选择80 ℃超声提取10 min作为提取条件。

2.2 色谱条件选择

参考文献[11]选择PRP X-100 色谱柱，同时配合预处理柱，使用25 mmol/L NH4H2PO4-乙醇(99∶1)溶液作为流动相等度洗脱。对流动相配制步骤进行优化，选择先加入乙醇再调节混合溶液的pH 值为6.7，减少超声次数，避免乙醇纯品作为流动相B 与流动相A 在线混合存在的排气慢、盐析出以及误操作导致高浓度有机相进入色谱柱等风险，同时加快洗脱速度，实现9 min 内洗脱完全。40 µg/L 混合标准溶液的色谱图见图1。

图1 6种砷形态混合标准溶液的色谱图

2.3 线性方程与检出限

分别以75As 的质量浓度为横坐标(x)、离子计数为纵坐标(y)建立线性回归方程。以试剂空白的3倍信噪比对应的质量分数作为方法检出限。

6种砷形态质量浓度线性范围、线性方程、相关系数和检出限见表5。结果表明，6 种砷形态在1.0～100.0 µg/L 范围内线性良好，相关系数为0.999 0～0.999 9，检出限均小于1.0 µg/kg。

表5 6种砷形态质量浓度线性范围、线性方程、相关系数及检出限

2.4 方法精密度试验

取肉蔻样品，按照实验方法平行测定6次，测定结果见表6。由表6可知，6种砷形态测定值的相对标准偏差均小于3.0%，表明方法精密度良好。

表6 精密度试验结果

2.5 加标回收试验

向肉蔻样品中加入1.0 mg/L的6种砷形态混合标准溶液40 µL，按选定条件平行提取3 次，测定各砷形态含量并计算平均回收率，结果见表7。由表7数据可知，6 种砷形态加标平均回收率为97.6%～104.7%，表明该提取方法稳定，样品中各砷形态保持较好，未发生明显转化。

表7 加标回收试验结果(n=3)

2.6 实际样品测定结果及提取率

用本方法分别测定茴香、草果、胡椒、肉蔻、辣椒5种香辛料中各砷形态、提取态总砷和总砷含量，分别计算提取率和砷形态检测回收比率(各砷形态检测到的含量之和与提取态总砷含量的比率)，结果见表8。肉蔻加标样品及对照空白的砷形态色谱图见图2。由分析结果可以看出，从方法提取率来看，不同品种香辛料提取率在96.7%～102.0%之间，提取效果良好。砷形态检测回收比率在96.5%～103.9%之间，表明各砷形态均被检出。各香辛料样品中砷形态以无机砷为主，含量占总砷含量的80%以上，食品中污染物限量国家标准中规定，调味料总砷不大于0.5 mg/kg，复合调味料无机砷不大于0.1 mg/kg，香辛料的限量要求虽然没有明确规定，但以其在饮食中不可或缺的作用以及在复合调味料中所占的比重来看，存在一定安全风险。

图2 空白样品和肉蔻加标样品中砷形态的色谱图

表8 5种香辛料样品中6种砷形态和总砷的测定结果、砷形态检测回收比率、提取率及无机砷比率(n=3)

3 结语

建立了超声辅助热酸提取预处理，LC-ICP-MS法测定香辛料中6 种砷形态的分析方法，采用正交试验确定砷形态提取的最佳条件。由方法学考证结果可知，该方法简便、快速、环保，提取率高、稳定性好，为香辛料中砷形态检测提供了分析方法参考。