同位素稀释-超高效液相色谱-串联质谱法测定化妆品中香兰素和乙基香兰素

黄键，王金娟，周元元，张敏，王红卫，王晓颖，孙雪婷

（南通海关综合技术中心，江苏 南通 226004）

香精与香料是化妆品生产中重要的原料之一，不仅可以提供令人愉悦的芳香气味，掩盖化妆品原料中的异味，而且可以其特殊的芳香气味提升化妆品的品质，提高产品对消费者的吸引力。相比天然提取物，人工合成的香精与香料组分单一，纯度更高，从某些方面来说，人工合成的香料在安全性上要比天然提取物更有保障，因此，人工合成的香精与香料广泛应用于化妆品生产等领域。香兰素是人类合成的第一种香料，又名香草醛，与其结构相似的是乙基香兰素，又名乙基香草醛。香兰素和乙基香兰素具有奶香味，是食品、化妆品领域中经常使用的人工合成香料。然而，摄入过多的香兰素会使人体产生不适，甚至损伤内脏器官，而皮肤接触化妆品中的香兰素会导致过敏反应[1]，因此测定化妆品中香兰素类香料含量具有重要意义。

针对化妆品中香料的检测方法主要有色谱法和色谱-质谱联用法，如气相色谱法[2‒3]、液相色谱法[4‒7]、气相色谱-质谱联用法[8‒12]、液相色谱-质谱联用法[13‒16]等。色谱法使用的仪器较为普及，但是受限于检测器的灵敏度，检出限较高且抗干扰能力较弱；色谱-质谱联用法灵敏度较高，但是化妆品对于某些目标物质具有较强的基质效应，样品处理过程较为复杂。

目前报道的香兰素类香料的检测大部分集中于食品领域[17‒20]，化妆品中该类香料的检测报道较少[21‒22]，均使用高效液相色谱法，检出限较高。笔者在前人研究的基础上，采用超高效液相色谱-串联质谱仪同时对化妆品中的香兰素和乙基香兰素进行分离和检测，进一步缩短了检测时间，降低了目标物质的检出限，并利用内标法定量消除了基质效应的影响，从而简化了样品预处理过程。该方法方便快捷、结果准确，为同时检测化妆品中的香兰素类香料提供技术参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱仪：1290 Infinity Ⅱ-6470 LC/TQ型，美国安捷伦科技有限公司。

分析天平：BS 224S 型，感量为0.1 mg，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

涡旋混合仪：LAB DANCE S25 型，德国IKA公司。

超声波仪：KQ-50E 型，昆山市超声仪器有限公司。

离心机：TG16 型，屹谱仪器制造(上海)有限公司。

超纯水机：Direct-Q型，德国默克密理博公司。

香兰素标准品：编号为STBC7969V，纯度(质量分数)为99.0%，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

乙基香兰素标准品：纯度(质量分数)为99.0%，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

香兰素-D3 标准品：纯度(质量分数)为99.0%，天津阿尔塔科技有限公司。

乙基香兰素-D5 标准品：纯度(质量分数)为99.5%，天津阿尔塔科技有限公司。

甲醇：色谱纯，美国天地有限公司。

甲酸：质谱级，美国ACS公司。

高纯氮气：纯度(体积分数)大于99.999%，南通天源气体有限公司。

实验用水为去离子水，电阻率不小于18 MΩ∙cm，自制。

化妆品样品：市售。

1.2 溶液配制

香兰素、乙基香兰素标准贮备液：质量浓度均约为1 000 mg/L，分别精确称取香兰素和乙基香兰素各0.01 g，用甲醇溶解后转移至2 只10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释并定容至标线，混匀。标准贮备液在4 ℃下可大约保存6个月。

香兰素、乙基香兰素混合标准中间液：质量浓度均约为1 mg/L，分别移取香兰素和乙基香兰素标准储备液各100 μL 至同一只100 mL 容量瓶中，加入甲醇稀释并定容至标线，混匀。标准混合中间液4 ℃下可大约保存3个月。

香兰素-D3、乙基香兰素-D5 同位素内标储备液：质量浓度均约为1 000 mg/L。分别精确称取香兰素-D3和乙基香兰素-D5各0.01 g，用甲醇溶解后转移至2 只10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释并定容至标线，混匀。该储备液在4 ℃下可大约保存6个月。

混合同位素内标溶液：香兰素-D3、乙基香兰素-D5质量浓度均约为1 mg/L，分别吸取香兰素-D3、乙基香兰素-D5 同位素内标储备液各100 μL 至同一只100 mL 容量瓶中，用甲醇稀释并定容，混匀。该溶液在4 ℃下可大约保存3个月。

香兰素、乙基香兰素系列混合标准工作溶液：精确移取香兰素、乙基香兰素混合标准中间液0.05、0.1、0.2、0.5、1 mL至10 mL容量瓶中，各加入0.5 mL混合同位素内标溶液，用体积分数为0.1%的甲酸水溶液-甲醇(体积比为80∶20)定容至标线，混匀，得到香兰素、乙基香兰素质量浓度均分别为5、10、20、50、100 μg/L的系列混合标准工作溶液，其中同位素内标的质量浓度均为50 μg/L。系列混合标准工作溶液需现用现配。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 液相色谱仪

色谱柱：RRHD Eclipse Plus C18柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国安捷伦科技有限公司)；柱温：25 ℃；进样体积：20 μL；流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为甲醇，流量为300 μL/min；洗脱方式：梯度淋洗；梯度淋洗程序：0～1 min时B相由20%逐渐增加到50%，1～2 min 时B 相为50%，2～2.5 min 时B 相由50%逐渐增加到80%，2.5～3 min 时B 相为80%，3～3.5 min时B相由80%逐渐减小到20%，3.5～5 min时B相为20%。

1.3.2 质谱仪

电离模式：电喷雾电离(ESI)；扫描模式：正离子模式；毛细管电压：3 500 V；干燥气：氮气，温度为325 ℃，流量为10 L/min；雾化气：氮气，压力为0.31 MPa；鞘气：氮气，温度为295 ℃，流量为11 L/min；碰撞气：氮气；数据采集模式：多反应监测(MRM)模式。表1为两种目标物及同位素内标经优化后的质谱分析参数。

表1 香兰素、乙基香兰素、香兰素-D3、乙基香兰素-D5质谱参数

1.4 实验方法

1.4.1 样品预处理

称取样品1.0 g (精确至0.000 1 g)，置于15 mL塑料离心管中，加入50 μL 混合同位素内标溶液及8 mL 甲醇，涡旋混匀，待样品全部溶解后用甲醇定容至10 mL，涡旋混匀1 min 后于超声波仪中提取15 min，然后将离心管在离心机中以8 000 r/min 转速离心分离5 min，精确量取1 mL上清液，经氮气吹干后加入1 mL 0.1%甲酸水溶液-甲醇(体积比为80∶20)，溶液过0.22 μm水相滤膜后备用。

1.4.2 测定方法

在1.3 仪器工作条件下，分别测定香兰素、乙基香兰素系列混合标准工作溶液，以目标物的质量浓度与相应同位素内标质量浓度的比值为横坐标，以目标物色谱峰面积与对应同位素内标色谱峰面积的比值为纵坐标，线性拟合后得到二者的标准工作曲线，以保留时间与离子对定性，内标法定量。

2 结果与讨论

2.1 分析方法选择

从化学结构上看，香兰素和乙基香兰素含有酚羟基、醛基和烷氧基，具有一定的极性，易溶于甲醇、乙醇和乙腈等有机溶剂，根据文献报道[21‒22]，采用反相C18色谱柱，通过调节色谱条件即可对二者进行分离，同时也可实现二者与基质中干扰物的有效分离，且色谱峰形理想。已报道的化妆品中香兰素类香料的检测方法为液相色谱法，使用的检测器为DAD检测器，受限于检测器的灵敏度，使用液相色谱法，香兰素定量限为0.07 mg/kg，乙基香兰素定量限为0.10 mg/kg[6]。质谱检测器可排除基质的干扰，且具有较高的灵敏度，因此选择液相色谱对二者进行分离，使用串联质谱对其进行检测，以降低其检测限。在实际样品的检测中发现，化妆品基质中的有机物会与目标物相互作用，导致目标物信号减弱，因此ESI源测定香兰素和乙基香兰素时具有较强信号抑制的基质效应，为消除基质效应的影响，提高实验的准确度，同时兼顾实验的效率，加入同位素内标，以内标法定量，整个过程无须衍生化，无须净化，操作简便，且定量准确。

2.2 色谱条件选择和优化

超高效液相色谱可使待测物的分离时间大为缩短，利用超高效液相色谱配套的RRHD Eclipse Plus C18型柱(50 mm×2.1 mm，1.8 μm)对香兰素和乙基香兰素进行分离，使用常用的溶剂如甲醇和乙腈为流动相时，香兰素和乙基香兰素均可实现较好的分离，且色谱峰形较为理想。在1.3的仪器条件下，香兰素和乙基香兰素的保留时间分别为1.75、2.10 min。使用该色谱柱可满足常规测试需求。

液相色谱法中常用甲醇、乙腈等溶剂作为有机相，盐或酸的水溶液作为水相，按一定比例混合后对待测物进行洗脱。实验发现，以甲醇、乙腈作为有机相时，对目标物的分离效果和色谱峰形无显著影响，而甲醇比乙腈价格便宜，具有成本优势，且毒性比乙腈小，故最终选择甲醇作为有机相。

由于香兰素和乙基香兰素显示为弱酸性，其化学结构中的酚羟基在水溶液中会部分电离，在选择流动相时可考虑使用酸性流动相以抑制二者在溶液中的电离，从而获得更为理想的色谱峰形，同时酸性流动相可提供离子化所需的质子，提高信号强度。因此，水相选择体积分数为0.1%的甲酸水溶液，通过调节水相和有机相的比例进行梯度洗脱。

2.3 质谱条件优化

香兰素和乙基香兰素均为弱极性化合物，二者在正离子模式和负离子模式下均可电离。一般说来，在相同条件下，ESI+模式下得到的信号强度高于ESI-模式，由于使用了酸性流动相，其中的氢离子可提供正离子扫描模式下离子化所需的质子，进一步提高信号强度，而在负离子扫描模式下，氢离子对待测物的离子化具有抑制作用，因此选用ESI+模式对二者进行离子化。通过对选择离子进行优化，香兰素的母离子为m/z153，选择优化后丰度较高的m/z65和m/z93作为监测离子；乙基香兰素的母离子为m/z167，选择m/z65和m/z93作为监测离子；香兰素-D3的母离子为m/z156，监测离子为m/z65；乙基香兰素-D5 的母离子为m/z172，监测离子为m/z65。图1～图4为混合标准溶液的MRM色谱图。

图1 香兰素的MRM色谱图

图2 香兰素-D3的MRM色谱图

图3 乙基香兰素的MRM色谱图

图4 乙基香兰素-D5的MRM色谱图

2.4 提取溶剂选择

化妆品检测时一般使用有机溶剂对样品进行溶解和对目标物质进行提取。常用于提取目标物的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈等。香兰素和乙基香兰素的化学结构中均含有酚羟基，为弱极性化合物，在甲醇、乙醇、乙腈等有机溶剂中溶解度较大。为了与流动相匹配，使用甲醇对化妆品样品进行溶解并对目标物质进行提取。实验发现，样品中加入甲醇涡旋混匀后，溶液为分散均匀的悬浊液或澄清溶液，高速离心后可得到较为清澈的上层溶液。如直接将上层清液过滤后上机测定，由于溶剂效应，得到的色谱峰存在肩峰的情况，因此取上层清液用氮吹仪干燥，再加入初始流动相定容，可得到较为理想的色谱峰形。图5与图6分别为空白样品溶液与加标样品溶液的选择离子色谱图。

图5 空白化妆品样品的色谱图

图6 空白加标样品色谱图

由图5和图6可以看出，虽然空白样品在相应的扫描条件下有几个杂质峰，但是从加标样品色谱图可以看出，基质杂质峰与目标物可实现基线分离，不影响对目标物质的测定，且杂峰数量较少，说明使用上述样品处理方法与质谱参数进行测试，可实现杂质和目标物质的分离，且有效降低基质对待测物质的干扰。

2.5 线性方程与检出限

按1.3仪器工作条件依次对香兰素、乙基香兰素系列混合标准工作溶液进行测定，以香兰素和乙基香兰素色谱峰面积与对应同位素内标色谱峰面积的比值(y)为纵坐标，二者的质量浓度与相应同位素内标质量浓度的比值(x)为横坐标，线性拟合后得到二者的标准工作曲线，分别计算二者的线性方程和线性相关系数。按实验方法对空白样品进行低质量浓度加标试验，逐渐降低加标的质量浓度，以3倍信噪比(S/N)时的质量浓度为检出限。香兰素和乙基香兰素的质量浓度线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表2。

表2 香兰素和乙基香兰素的质量浓度线性范围、线性方程、相关系数及检出限

由表2可知，香兰素和乙基香兰素的质量浓度在5～100 μg/L 范围内线性良好，相关系数均为0.999 8，香兰素和乙基香兰素的方法检出限均为5 μg/kg。

2.6 加标回收与精密度试验

选用空白化妆品为基质，按1.4实验方法测定并进行加标回收试验，加标量分别为100、500、1 000 μg/kg，每个加标浓度水平平行测定6 次，测定结果见表3。由表3可知，香兰素平均回收率为87.8%～96.1%，测定结果的相对标准偏差为2.5%～3.8%，乙基香兰素平均回收率为80.1%～83.8%，测定结果的相对标准偏差为1.7%～4.6%，方法精密度、准确度均满足要求。

表3 加标回收与精密度试验结果

3 结语

采用超高效液相色谱-串联质谱法对化妆品中的香兰素和乙基香兰素进行分离和测定，在5 min内成功实现了2种化合物的分离检测。该方法操作简便，准确度高，为化妆品中香兰素类香料的筛查和测定提供了一定的借鉴。