尖孢镰刀菌Six1d启动子的克隆及其在真菌分泌表达载体构建中的应用

彭存智　常丽丽　王丹　黄超　徐兵强　仝征

关键词：香蕉枯萎病；内源启动子；分泌表达载体；Six1d 蛋白

中图分类号：S436.68 文献标识码：A

香蕉枯萎病是危害香蕉产业的重要病害，而尖孢镰刀菌古巴营养专化型（Fusarium oxysporumf.sp. cubense， Foc）是引起这种病害的病原真菌，可导致香蕉严重减产，甚至绝收。根据对不同香蕉品系的致病性Foc 可细分为4 个生理小种，包括1 号小种（race 1，Foc1）、2 号小种（race 2，Foc2）、3 号小种（race 3，Foc3）和4 号小种（race4，Foc4），其中Foc4 具有广泛的寄主范围，根据病害发生是否受冷害胁迫以及发生的地理区域可进一步区分为热带4 号小种（tropical race 4，Foc TR4）和亚热带4 号小种（subtropical race 4，Foc STR4）[1-3]。Foc TR4 在所有生理小种中致病性最强对我国南方香蕉主产区危害最大，尤其对Cavendish 系列香蕉有致命的侵害作用[3] 。Cavendish 香蕉是国内目前栽培面积最大、产量最多的品种群，但市场欢迎度较高的一些品种（如巴西蕉等），对Foc TR4 极度易感[4]。通过引进和自选获得的一些抗枯萎病栽培品种（如南天黄等）虽然对Foc TR4 具有一定的抗性，但这类抗病性易受环境影响，且植株的发病率会随着土壤中Foc TR4 孢子含量的增加而显著上升[5]。因此，加强对香蕉枯萎病抗感病机制研究将有助于培育香蕉枯萎病抗性新品种。病原菌在侵染寄主植物致病的过程中，会分泌一系列蛋白质、酶和毒素阻止植物的防御反应，从而有利于自身的生存和繁殖[6-7]，而植物免疫系统可通过识别某些分泌蛋白来产生抗病性[8]。在Foc 的研究中，人们通过观察携带真菌表达载体pCT74 的Foc1 和Foc TR4侵染香蕉根部的过程，已经阐释了一些Foc 的致病机制[9]。

研究发现，丝状真菌在表达某些内源基因时的产量特别高，表明丝状真菌基因组中存在强启动子，能够驱动内源基因的高效表达[10-11]。使用内源强启动子有利于在体内高效、稳定、特异地表达外源目标基因[12]。已报道的丝状真菌启动子有瑞氏木霉纤维二糖水解酶基因（cellobiohydrolase，cbh1）启动子，构巢曲霉的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gpdA）启动子，曲霉葡糖淀粉酶基因（glucoamylase，glaA）启动子[13]，橡胶树白粉菌（HO-73）启动子[14]等。本研究团队前期已将Foc1 高丰度分泌表达蛋白secreted in xylem 1d（Six1d）[15]的N 端分泌信号肽连接至常用真菌表达载体pCT74 中，构建了新型真菌分泌载体p74HSP- EGFP，该载体可将绿色荧光蛋白EGFP 分泌至Foc TR4 菌体外，并在Foc TR4 菌株侵染香蕉过程中将EGFP 蛋白分泌到香蕉根部[16]。为了能在Foc 菌株中更高效表达内源基因，本研究在已有的p74HSP- EGFP载体基础上，克隆到Foc1 Six1d 基因的启动子，并替换p74HSP-EGFP 载体中的ToxA 启动子，将p74HSP-EGFP 进一步改造为由Foc 内源启动子驱动的分泌表达载体。通过比较ToxA 启动子和Six1d启动子驱动绿色荧光蛋白的荧光强度以及表达丰度，证明Six1d 启动子在Foc 中的表达活性比ToxA启动子高，为后续研究Foc 致病相关蛋白或抗病相关外源蛋白在香蕉枯萎病中的作用机理提供重要的实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 Foc1 由中国热带农业科学院热带生物技术研究所曾会才博士提供，Foc TR4 由中国热带农业科学院热带生物技术研究所周登博博士提供， 非分泌型真菌表达转化菌株FocTR4-HPG 由本实验室保存。用于载体构建的大肠杆菌菌株DH5α 购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

1.1.2 质粒 真菌表达载体p74HSP-EGFP 由本实验室构建和保存[9]，该载体含有潮霉素B 磷酸转移酶基因（ hygR ） ， 增強型绿色荧光基因（EGFP），来源于小麦黄斑病菌（Pyrenophoratritici-repentis）的ToxA 启动子[17]，以及来源于Foc1 的Six1d 蛋白分泌信号肽。

1.1.3 培养基及试剂 LB 培养基：10 g/L NaCl，10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物；土豆液体培养基（PDB）：200 g 土豆切丝，加水煮沸15～20 min，纱布过滤，加入20 g 蔗糖，定容到1 L，高温灭菌；土豆琼脂培养基（PDA）：PDB 中添加9 g/L 琼脂粉；液体再生培养基：PDB 中添加274 g/L 蔗糖；固体再生培养基：液体再生培养基中添加9 g/L 琼脂粉；钾盐液体培养基（KK）：1.0 g/L K₂HPO₄， 0.5 g/L KCl， 0.5g/L MgSO₄·7H₂O，0.01 g/L Fe-Na EDTA， 2.0 g/L 天门冬酰胺和10.0 g/L D-半乳糖，pH 5.0；溶酶液：0.1 mol/LNaH₂PO₄， 0.8 mol/L NaCl，pH 5.8；酶解液：10 mg/mL 崩溃酶（Drislase， Sigma），10 mg/mL溶壁酶（Lysing Enzyme， Sigma），加入溶酶液，80 r/min 摇床振荡溶解30 min，过滤除菌。原生质体转化相关试剂：0.8 mol/L NaC1 溶液；STC 溶液：1.2 mol/L Sorbitol，10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），50 mmol/L CaCl₂，过滤除菌；60% PTC 溶液：STC溶解PEG4000 配制成60%溶液，过滤除菌。

1.2 方法

1.2.1 真菌基因组DNA 的提取 取直径约5 mm的真菌菌盘接种到20 mL 的PDB 液体培养基中，28 ℃，200 r/min 震荡培养3 d，过滤收集菌丝。分别称取100 mg 菌丝到2 mL 离心管中，置于液氮中冷冻2 min，用高速组织研磨仪破碎菌丝（Servicebio， China），最后用植物基因组DNA提取试剂盒（Tiangen， China）进行真菌基因组DNA 的提取。

1.2.2 Six1d 启动子的扩增 根据Foc1 基因组测序序列（GenBank No. KB730415.1）中Six1d 基因上游序列设计特异引物对（表1），以Foc1 基因组DNA 为模版，通过PrimeSTAR Max DNA Polymerase（Takara， Japan）扩增Six1d 启动子，反应条件为：94 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共32 个循环。扩增产物纯化后保存备用。

1.2.3 pSix1d74HSPG 载体的构建，测序和启动子元件分析 p74HSP-EGFP 载体的ToxA 启动子区域通过Hind Ⅲ酶切后补平，再用Cla I 酶切，切除ToxA 启动子。将扩增获得的Six1d 启动子序列片段同样用ClaⅠ酶切，连接进p74HSP-EGFP载体片段中，构建得到完整的载体pSix1d74-HSPG。载体转化大肠杆菌DH5α，寄送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。测序结果提交到http：//bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/，进行启动子元件在线分析。

1.2.4 原生质体制备及转化 主要参考黄东杰等[18]的方法，并进行适当的改良。接种Foc TR4 菌株到20 mL PDB 液体培养基中，28 ℃，200 r/min摇床培养3～4 d。3 层无菌擦镜纸过滤菌液，滤液转移到100 mL PDB 中扩大培养10～12 h。3 层无菌擦镜纸过滤菌液收集菌丝，无菌水冲洗2 遍，0.8 mol NaCl 溶液冲洗2 遍。菌丝转移到250 mL无菌三角瓶中，称重，按照每0.2 g 菌丝加入10 mL酶解液的比例进行酶解，28 ℃，80 r/min 摇床避光酶解3.5 h。酶解的菌液用5 层无菌擦镜纸过滤，预冷0.8 mol NaCl 溶液冲洗并收集到50 mL 离心管中，4 ℃，5000 r/min 离心15 min。弃上清，加入5 mL 预冷的STC 溶液重悬，4 ℃，5000 r/min离心15 min。弃上清，加入适量的STC 溶液重悬，使原生质体浓度至约1×10⁸CFU/mL。按照200 μL原生质体、50 μL 质粒或DNA （5～10 μg）、50 μLPTC 的顺序加入15 mL 离心管中，混匀后冰浴30 min。加入2 mL PTC，混匀后室温放置20 min。加入3 mL 液体再生培养基，混匀后28 ℃，光照静置培养12～14 h。5000 r/min 离心15 min，弃上清4 mL，剩余菌液重悬后转入40 mL 融化的固体再生培养基（45～55 ℃）中，混匀后倒入9 mm 培养皿，凝固后再倒入含100 μg/mL 潮霉素B 的PDA 培养基。3～5 d 后长出转化子，将转化子转至新的含100 μg/mL 潮霉素B 的PDA 培养基上进行再次筛选。重复转接3～4 次，以获得性状稳定的转化菌株。

1.2.5 真菌表达载体转化菌株的鉴定 转化菌株接种到20 mL 含100 μg/mL 潮霉素B 的PDB 中，28 ℃，200 r/min 震荡培养3 d，按照前面所述方法收集菌丝并提取真菌基因组DNA。根据EGFP 基因序列设计特异引物对（表1），通过PCR 反应检测携带EGFP 基因的真菌表达载体是否成功导入Foc TR4。反应条件为94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃60 s，共32 个循环，扩增产物为646 bp DNA 片段。

1.2.6 菌液的显微镜荧光观察以及荧光强度和EGFP 蛋白含量变化的检测 将转化菌株分别接种到200 mL 含100 μg/mL 潮霉素B 的KK 液体培养基中，在28 ℃，200 r/min 条件下摇床振荡培养，每24 h 分别吸取20 μL 菌液进行荧光显微镜（Olympus， USA）观察。培养到第5 天，通过紫外可见分光光度计（Techcomp， China）测定菌液浓度，用KK 液体培养基统一稀释到OD600=1.5的浓度，各取50 mL 菌液用0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌。分别吸取200 μL 过滤后的溶液，通过全波长多功能酶标仪（Bio-Tek， USA）检测溶液的荧光强度值（激发波长为488 nm，发射波长为528 nm）。以上数据检测重复3 次。同时采用本实验室改进的蛋白提取方法[19]提取上述过滤后液体培养基中的总蛋白，用BRADFORD[20]的方法测定蛋白浓度。分别取20 μg 总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，Image scanner Ⅲ图像扫描系统（GE， USA）扫描凝胶获取图片，并利用ImageJ软件计算蛋白质条带的灰度值[21]，获得EGFP 蛋白表达量的相对变化。Western blot 检测采用TONG 等[22]描述的方法进行，利用GFP 兔单克隆抗体（Beyotime， China）检测EGFP 蛋白的表达量。以上荧光强度和EGFP 蛋白含量变化的检测实验均重复3 次。

1.3 數据处理

以Excel 2010 软件的统计工具对数据进行均值和标准偏差分析。

2 结果与分析

2.1 Six1d 启动子的克隆，pSix1d74HSPG 载体的构建及顺式作用元件分析

以Foc1 的基因组DNA 为模版，通过特异引物SixPro-F 和SixPro-R 进行PCR 扩增，获得Six1d启动子目的条带，纯化回收备用。同时利用HindIII 限制性内切酶对分泌表达载体p74HSP-EGFP的ToxA 启动子下游末端进行酶切，补平粘性末端。再用Cla I 限制性内切酶酶切，切除ToxA 启动子，获得载体片段。随后将克隆的Six1d 启动子片段通过Cla I 酶切后，连接进p74HSP-EGFP 载体片段中，构建的新载体命名为pSix1d74HSPG（图1）。

将携带pSix1d74HSPG 载体的DH5α 菌株寄送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果表明，克隆的Six1d 启动子片段序列长度为1999 bp，与公布的Foc1 基因组（Accession No.KB730415）中的序列一致。将序列提交到启动子元件预测分析网站Plant CARE[23]进行分析。结果表明，启动子中除了CAAT-box、TATA-box 等核心元件以外， 同时还含有ABRE 、AuxRR-core 、CGTCA-motif/TGACG-motif 激素类响应元件，ARE、LTR、MBS 环境胁迫类响应元件以及G-box、Sp1 等光响应元件（图2）。

2.2 p74HSP-EGFP 和pSix1d74HSPG 载体对Foc TR4 菌株的转化及PCR 鉴定

真菌分泌表达载体p74HSP-EGFP 和pSix1d74HSPG 转化Foc TR4 的原生质体后，将长出的转化菌株转至新的含100 μg/mL 潮霉素B 的PDA 培养基上进行再次筛选。培养5 d 后，挑选并接种正常生长的转化菌株到PDB 中继续培养，然后收集菌丝提取基因组DNA，通过EGFP 基因特异引物对（表1）进行PCR 鉴定。对鉴定成功的阳性转化菌株进行转接培养，重复2～3 次，获得性状稳定的阳性转化菌株，分别命名为FocTR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG。PCR 鉴定结果显示，从Foc TR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG菌株DNA 中均能扩增出646 bp 的EGFP 基因片段，表明真菌表达载体p74HSP-EGFP 和pSix1d74HSPG 已成功转入Foc TR4 菌株中（图3）。

2.3 转化菌株的荧光显微镜观察

分别将Foc TR4 野生型菌株，Foc TR4-HPG、Foc TR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG 转化菌株接种到KK 液体培养基中振荡培养，培养期间每隔24 h 吸取菌液通过荧光显微镜进行观察（图4）。结果显示，在明场的可见光下，不同时期菌丝生长形态均表现正常，没有明显区别（图中仅显示培养120 h 的明场图片）。在488 nm 激发光下，Foc TR4 野生型菌落不发绿色荧光；Foc TR4-HPG携带的是非分泌型真菌表达载体，菌丝能发出明亮的绿色荧光，但没有明显的荧光背景，只是在培养后期可能由于EGFP 蛋白的逸出，才出现微弱的荧光背景； Foc TR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG 携带的是分泌型真菌表达载体，在培养早期就由于表达并分泌EGFP 蛋白而出现绿色荧光背景，随着培养时间的增加，荧光背景逐渐增强，其中Foc TR4-Six1dHSPG 的荧光背景更加明亮。结果表明Foc TR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG 菌株在液体培养过程中表达的EGFP绿色荧光蛋白不断分泌到培养基中，导致液体培养基中出现明显的绿色荧光背景。Foc TR4-Six1dHSPG 的绿色荧光背景比Foc TR4-HSPG 的更加明亮，表明Foc TR4-Six1dHSPG 中的EGFP表达量更高，分泌到液体培养基中的EGFP 蛋白相应更多。

2.4 液體培养基荧光强度的测定和分析

转化菌株在培养过程中不断分泌EGFP 蛋白到液体培养基中，影响培养基的荧光强度。因此，测定液体培养基的荧光强度可间接反映EGFP 表达量的差异，从而比较Six1d 启动子与ToxA 启动子驱动EGFP 表达的的活性强度差异。为此，进一步检测了培养120 h 的不同菌株液体培养基荧光强度。结果显示，Foc TR4 的液体培养基滤液荧光强度值为3059.25±49.04；Foc TR4-HSPG 的荧光强度值为84 560.25±1161.16，是Foc TR4 野生型菌株的27.6 倍；Foc TR4-Six1dHSPG 的荧光强度值为138 572.5±1987.32，是Foc TR4-HSPG菌株的1.6 倍（ 图5） 。以上研究结果说明pSix1d74HSPG 载体中的Six1d 启动子活性高于p74HSP-EGFP 载体中的ToxA 启动子活性。

2.5 EGFP蛋白表达检测和分析

采用本实验室改进的蛋白提取方法[19]，提取上述菌液过滤后液体培养基中的总蛋白。利用Bradford 方法测定蛋白浓度后，取15 μg 总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（ 图6 ） 。在p74HSP-EGFP 和pSix1d74HSPG 载体中，EGFP的N 端均加入了分泌信号肽序列，全长271 个氨基酸，分子量约为30.3 kDa。电泳结果显示，FocTR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG 均有EGFP 蛋白的表达，分子量大小和预估的30.3 kDa 基本一致，而作为对照的Foc TR4 野生型菌株中没有EGFP 蛋白的表达条带（图6A）。通过ImageJ软件计算EGFP 蛋白条带的灰度值，结果显示，Foc TR4-HSPG 的EGFP 蛋白条带灰度值为12 508.33±1063.94，Foc TR4-Six1dHSPG 的EGFP蛋白条带灰度值为21 281.42±1868.97，是FocTR4-HSPG 的1.7 倍，与之相对应的Foc TR4-Six1dHSPG 的EGFP 蛋白表达量也是FocTR4-HSPG 的1.7 倍（图6B），该结果和菌液中荧光强度值的倍数差异相似。

随后，通过Western blot 来直接检测转化菌株分泌蛋白中EGFP 蛋白的表达量，结果显示，FocTR4-HSPG 和Foc TR4-Six1dHSPG 均检测到EGFP 蛋白的表达，而作为对照的Foc TR4 野生型菌株中没有EGFP 蛋白的表达条带（图6C），这一结果与聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验结果相同。进一步通过ImageJ 软件计算Western blot 膜上EGFP 蛋白表达条带的灰度值，数据显示FocTR4-HSPG 的EGFP 蛋白条带灰度值为29 164.39±429.73，Foc TR4-Six1dHSPG 的EGFP 蛋白条带灰度值为46 915.92±559.16，是Foc TR4-HSPG 的1.61 倍（图6D），这一数据结果和菌液中荧光强度值的倍数差异也比较一致。上述EGFP 蛋白表达检测和分析结果表明，pSix1d74HSPG 载体中的Six1d 启动子与p74HSP-EGFP 载体中的ToxA 启动子相比有更高的表达活性。

3 讨论

香蕉枯萎病是危害香蕉产业的重要病害，通过对尖孢镰刀菌致病机理以及香蕉的抗病机制等方面的研究，已分离鉴定出一批相关基因。利用植物病毒表达载体[24]，农杆菌介导的表达载体[25]和酵母表达载体系统[26]等可以鉴定基因的功能，但存在许多局限性，同时这些鉴定方法操作程序复杂，鉴定途径为非直接方式，鉴定结果容易出错等问题。

pCT74 是一种常用的真菌表达载体，携带潮霉素Hyg 抗性筛选标记，利用ToxA 启动子可在多种丝状真菌中高效表达绿色荧光蛋白，达到蛋白定位的目的，但只能在胞内表达，无法真实反映一些特异目标蛋白的功能[17， 27]。因此，本研究团队已在pCT74 载体的基础上，构建了携带分泌信号肽的真菌分泌表达载体p74HSP-EGFP，该载体可在真菌病原菌中表达携带的目的基因，并在侵染植物的过程中将目的蛋白分泌到植物体内，实现蛋白功能的验证[16]。相对于利用香蕉遗传转化体系验证目标蛋白功能的传统方法，利用真菌分泌表达载体的验证方法具有用时短、可操作性强、直观高效等优点。

近年来许多研究表明，利用内源启动子表达外源基因往往具有更强的目的性，更高的表达效率。卢姗等[28]通过用马尔尼菲青霉菌微管蛋白β亚基基因启动子替换粗脉孢菌苯菌灵抗性基因启动子，构建了苯菌灵抗性基因表达盒，成功地运用于马尔尼菲青霉菌的遗传转化研究中。聂燕华等[29]克隆了银耳芽孢内源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， gpd）启动子，与多功能纤维素基因（multi-functionalcellulose， mfc）连接并构建表达载体，转化银耳芽孢后，酶活发酵试验表明多功能纤维素酶的表达量提高了34.3%。真菌分泌表达载体p74HSPEGFP中的ToxA 启动子来源于小麦黄斑病真菌（Pyrenophora tritici-repentis）[17]，虽然在大部分真菌，包括Foc 中都可以启动基因的表达，但为了在Foc 中更高效地表达外源基因，Foc 自身的启动子可能会更加适合。本研究团队在前期对Foc1 的分泌蛋白质组研究结果中发现，Foc1 在单独培养或与香蕉根共培养的过程中，Six1d 蛋白都能高效分泌表达[15]，因此本研究先克隆到Six1d基因的啟动子，并替换p74HSP-EGFP 中的ToxA启动子，构建能够在尖孢镰刀菌中更好表达目的基因的真菌分泌表达载体pSix1d74HSPG。

在基因工程中，启动子的强度是决定外源蛋白表达的关键因素。启动子的强度可以通过研究转录因子对其序列的结合亲和力或评估启动子驱动的基因的表达水平来确定[12]。本课题组研究的2 种转化菌株携带的是真菌分泌表达载体，转化菌株在培养过程中会在不断表达外源基因的同时，将已合成的目的蛋白同步向细胞外分泌，不会造成细胞内目的蛋白的过量积累，只会增加培养基中目的蛋白的总量。因此在一定的培养时间范围内，培养基中目的蛋白的总量和启动子的活性呈现一定的线性相关。在本研究中，真菌分泌表达载体表达的EGFP 绿色荧光蛋白在培养过程中不断分泌到液体培养基中，随着培养基中EGFP荧光蛋白总量的提高，逐步提高培养基的荧光背景，从而可以通过检测培养基中EGFP 荧光强度的变化来判断启动子表达强度的差异。研究发现，真菌分泌表达载体p74HSP-EGFP 和pSix1d74HSPG的Foc TR4 转化菌株Foc TR4-HSPG 和FocTR4-Six1dHSPG 分别在KK 液体培养基（含潮霉素B 100 μg/mL）中振荡培养24 h 后，就能观察到少量的荧光背景，表明均有EGFP 蛋白的表达并分泌到培养基中。随着培养时间的增加，观察到的荧光背景也在逐步增强，并且Foc TR4-Six-1dHSPG 产生的荧光背景高于Foc TR4-HSPG。结合菌液过滤后上清液中的荧光强度以及EGFP 蛋白表达量的检测数据，进一步证实Foc TR4-Six-1dHSPG 菌液中的EGFP 蛋白表达量是Foc TR4-HSPG 的1.6～1.7 倍。

以上研究结果表明，新构建的真菌分泌表达载体pSix1d74HSPG 中的Six1d 内源启动子拥有完整的启动子功能，表达强度显著高于p74HSPEGFP载体中的ToxA 启动子，具有明显的内源表达优势，达到ToxA 启动子的1.6～1.7 倍。pSix1d74-HSPG 载体完全能够代替原来的p74HSP-EGFP 载体，可以在Foc 中更高效表达并分泌目的蛋白，从而为香蕉枯萎病抗感病分子机理研究提供重要的实验工具。