大白菜叶片响应菌核病侵染的转录组分析

冯冬林　丁玲　刘美琴　钟开勤

关键词：大白菜；菌核病；转录组；差异表达基因

中图分类号：S436.341.1 文獻标识码：A

大白菜（Brassica campestris syn. rapa L. ssp.pekinensis）原产中国，属于十字花科芸薹属，是我国栽培面积最大的蔬菜作物之一。大白菜菌核病是由核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum （Lib.） deBary]引起的一种具有土传性的真菌病害，主要危害叶片和茎秆。近年来大白菜菌核病呈逐年上升趋势，在福建省，每年12—4 月为菌核病发病严重期，少则造成产量损失10%～30%，严重时可减产50%以上[1]。

菌核病的防治主要以化学防治为主，但是长期大量使用化学药剂造成土壤污染及食品安全等问题，培育大白菜抗病品种是应对生态友好型最有效的办法。近年来， 基因组学辅助育种（genome-assisted breeding， GAB）将基因组学与高通量表型分析相结合创造新种质，已成为一种高效的育种模式[2]。

植物在长期的进化过程中，通过多重防御系统以抵抗病原菌入侵，在病原菌入侵的情况下，利用转录组全面分析该时期的全部基因表达情况，以揭示植物在某一时刻、某个组织中转录水平上的调控机制[3-4]。本研究以不同抗性大白菜自交系材料接种核盘菌，进行转录组测序，筛选出抗病相关差异表达基因，探讨差异表达基因调控机制，为大白菜应答菌核病的分子机制及抗病品种的选育提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

前期对20 个大白菜品种和自交系经幼苗进行离体叶片菌核病抗性鉴定，筛选出抗性自交系材料H72 及感性自交系材料Y26 作为本研究材料。大白菜核盘菌菌株从大田分离、鉴定并保存。

1.2 方法

1.2.1 植株培养 将自交系材料H72 与Y26 种子用75%酒精消毒处理90 s，再用蒸馏水冲洗2～3次，置于22 ℃光照培养箱中催芽2 d，将露白的种子点播于穴盘中，在大棚自然条件下生长，基质由草炭土、椰糠和跖石按1∶2∶1 混匀而成，待试验材料长至2～3 片真叶后接种。

1.2.2 试验处理 切取活化的核盘菌菌块5 mm×5 mm，将有菌丝的一面接种到叶片中央，以无菌丝的琼脂块作为空白对照，接种叶片时尽量避开叶脉，最后喷洒定量无菌水，盖上培养皿，将接种的叶片水平放置于培养箱中，温度设为22 ℃，相对湿度保持在85%左右。

收集在PDA 平板上培养15 d 的核盘菌，捣碎并加无菌水，过滤后制成浓度为1×106 个/mL的孢子悬浮液，待植株长至2～3 片叶期，用接种针刺叶片，将孢子悬浮液均匀喷雾于植株叶片，收集分别接种0、36、48 h 的自交系材料H72 与Y26叶片，每个样品0.5 g，每个处理3 个重复，经液氮速冻后于?80 ℃冰箱保存，用于转录组测序。

1.2.3 H2O2 检测 DAB（3，3'-diaminobenzidine-HCl）染色检测法参照GUAN 等[5]的方法并加以改进。将接种36、48 h 后的大白菜叶片置于pH为3.8 的1 mg/mL DAB 溶液中，染色6 h 后于沸腾的75%酒精中脱色8 min，冷却后，于无水乙醇中室温保存。

1.2.4 文库构建及转录组测序总 RNA 提取应用Trizol 法（Invitrogen），使用Agilent 2100 bioanalyzer检测RNA 完整性和总量。构建cDNA文库，使用Qubit 2.0 Fluorometer 和Agilent 2100bioanalyzer 对文库进行检测，在Illumina NovaSeq6000 平台进行转录组测序。

1.2.5 测序原始数据分析测序获得的图像数据经CASAVA 碱基识别转化为原始序列数据（rawreads），去除含接头、含N（无法确定碱基信息）、低质量reads 后，获得clean data，与大白菜参考基因组（http：//brassicadb.org/brad/）进行序列比对。使用DESeq2 软件（1.20.0）进行2 个比较组合之间的差异表达分析。使用Benjamini-Hochberg 方法调整所得P 值（P-adjust），以控制错误发现率。差异表达的阈值设定为P-adjust≤0.05 & |log2FC|≥4。根据基因在不同处理时间及抗、感品系中的差异表达、功能注释和功能富集等表达水平进行分析。

1.2.6 qPCR 验证 选取8 个差异表达基因设计引物，以转录组测序用的cDNA 为模板，内参基因为Actin（表１），用转录组测序同批次采集样品的cDNA 为模板，使用荧光定量PCR 仪（ABIQuantStudio 3）进行qPCR 分析。设3 次生物学重复，按照2^-ΔΔC_T算法计算基因的相对表达量。使用SPSS 软件分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 H2O2 的累积情况

利用DAB 染色检测核盘菌侵染大白菜叶片过程中的活性氧（ROS）发生水平和H2O2 累积情况。结果显示，在接种后36、48 h，大白菜H72的染色区域明显小于Y26，在36 h 时已表现出明显差异（图1），表明大白菜H72 的抗性强于Y26。

2.2 转录组测序

转录组测序共获得121.77 Gb 的clean data，对原始测序数据进行过滤，各样品clean data 均达到6 Gb 以上，Q30 碱基百分比在90%以上，GC含量达40%以上（表2）。

2.3 差异表达基因筛选与分析

在差异表达阈值设定为P-adjust ≤0.05 &|log2FC|≥4 的基础上，将抗病H72 和感病Y26 材料分别在接种36、48 h 后进行比对，抗感病材料间及抗感病材料内共有差异表达基因分别为13、11 个（图2）。

2.4 抗病调控关键基因

从菌核病侵染后抗病材料H72 和感病材料Y26 的共有差異表达基因中，筛选到抗病相关的差异基因11 个，差异均达显著性水平（P<0.05，表3）。

基因ESP 为上皮硫特异蛋白（epithiospecifier protein）基因，拟南芥中ESP 基因调节吲哚-3-乙腈（IACN）的产生，在植物叶片衰老过程中起负调节的作用[6-7]。Bra103871086（ESP）在H72 和Y26 均为下调表达。

类钙调磷酸酶B 蛋白基因（CBL1）、天冬氨酸蛋白酶基因（AED3）、热激蛋白基因（DnaJ 11）能够调节植物应答生物胁迫和非生物胁迫，在植物抗逆和次生代谢过程中起重要作用[8-10]。本研究中CBL1 表现为下调表达，且在H72 中的表达量低于Y26；AED3、DnaJ 11 为上调表达，且在H72 中的表达量高于Y26。

转录因子ERF、MYB 参与胁迫信号转导路径，在响应生物胁迫和非生物胁迫及植物生长发育等方面起重要作用[11-12]。基因MYB34 为上调表达，ERF003 为下调表达。

F-box、类甜蛋白基因（TLP1）、氨基酸转运酶基因（ANT1）、生长素原初反应基因（GH3.3）、咖啡酰辅酶A 氧甲基转移酶基因（Cco AOMT）在H72 和Y26 中均上调表达，且在H72 中的表达量显著高于Y26。

2.5 qPCR 验证

选择8 个差异表达基因，应用qPCR 验证其在抗、感大白菜材料中的表达情况（图3）。结果表明，ERF003、CBL1、AED3 在2 个材料侵染36、48 h 均下调表达，其中ERF003、CBL1 在H72 中的表达量低于Y26，与转录组结果一致；CcoAOMT、GH3.3、MYB34、ANT1、TLP1 在2 个材料侵染36、48 h 均上调表达，并且在H72 中的表达量高于Y26，转录组分析Cco AOMT 在病菌侵染48 h 的H72 中的表达量低于Y26，其他结果与转录组分析一致。以上分析表明，qPCR 结果与转录组测序结果基本一致，表明转录组测序结果准确可靠。

3 讨论

本研究选用抗、感菌核病的大白菜品系，利用叶片接种菌核病菌，在转录水平分析2 种材料在接种0、36、48 h 后相关抗病差异基因的表达。构建了抗病组（H72）与感病组（Y26）大白菜叶片cDNA 文库，结果显示，抗、感大白菜自交系随着菌核病菌侵染时间的延长，高质量序列和差异表达基因数量均显著增多。对差异表达基因进行分析，鉴定出11 个抗病相关基因。

3.1 转录因子调控大白菜菌核病抗性

MYB34 是调控芥子油苷代谢通路的R2R3-MYB 转录因子之一，不仅可以提高吲哚族芥子油苷的含量，而且还可以提高生长素的含量[13-14]。核盘菌、伏马菌素B1 侵染拟南芥及在ABA 和JA处理下吲哚-3-甲基芥子油苷显著升高，吲哚类芥子油苷很可能参与了拟南芥对核盘菌侵染的防卫反应[15-16]。本研究中MYB34 在病菌侵染48 h后显著上调，且在H72 中的表达量显著高于Y26，MYB34 表达量增强，可能调控了ABA、SA、JA等介导的吲哚类芥子油苷的合成，从而调节植物的抗逆防御水平。

ERF003 基因属于AP2-ERF 类转录因子，ERF转录因子同乙烯响应元件相结合，通过调节乙烯的表达，从而参与植物胁迫过程调节植物生长和发育[17]。拟南芥AtERF3/4 与下游基因结合时则发挥抑制子的作用[12]；桃树（Prunus persica）转录因子PpERF3 调节PpNCED2/3 的表达，从而调节桃子果实的成熟[18]；吕静[19]认为水稻Os ERF3正调控对二化螟的抗性而负调控对褐飞虱的抗性；干旱、盐胁迫处理甘薯后，IbERF3 在根和叶片中的表达量均显著上升[20]；王峰等[21]推测杂交杨丝裂原活化蛋白激酶MAPK6 调控PtdERF3，正向调控锈病侵染。本研究中ERF003 在接种后36、48 h 均为下调表达，具体如何参与大白菜抗菌核病还需进一步研究。

3.2 植物激素信号转导与大白菜菌核病抗性

生长素（auxin）是植物重要的内源激素，能够诱导早期响应基因Aux/IAAs、GH3s 和SAURs的表达，从而提高对于胁迫的抵抗能力[22]，生长素早期响应蛋白GH3 基因参与调控植物多个生理过程， 及相应生物和非生物胁迫[23]， 水稻OsGH3.3 能够提高水稻细菌性病害的抗性[24]，本研究中GH3.3 在菌核病侵染36、48 h 后表达量显著上升，且在H72 中的表达量显著高于Y26，推测GH3.3 在抗菌核病过程中起着重要作用。

3.3 病程相关基因介导大白菜菌核病抗性

类甜蛋白（thaumatin-like proteins， TLPs）属于病程相关蛋白（PR）家族的PR-5 亚族，是一种重要的植物病源防御蛋白。TLP 基因对小麦雪霉病、水稻纹枯病、油菜菌核病等具有抗性[25-27]，栗小英等[28]研究表明，TaLr19TLP1 基因受叶锈菌、脱落酸和水杨酸的诱导，参与小麦抗叶锈防御反应。TLP1 在菌核病侵染36、48 h 均上调表达，且在H72 中的表达量显著高于Y26，表明TLP1 可能参与菌核病的防御反应。

3.4 其他基因与大白菜菌核病抗性

ESP能对黑芥子酶催化的芥子油苷水解产物的组成起调节作用，芥子油苷及其代谢产物在植物抵御食草动物、害虫和病原微生物的防卫反应中发挥重要作用。过表达拟南芥AtESP 和白菜BcESP 可以调控芥子油苷的代谢，从而调节植物的抗虫和抗病防御[29-32]；植物体内参与苯丙烷途径和水杨酸（SA）途径的基因在木质素生物合成及植物免疫方面具有重要的作用。咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶（caffeoyl CoA O-methyltransferase，CcoAOMT）是调控木质素合成的关键酶之一，转基因CcoAOMT 烟草下调表达，使木质素含量大幅下降[33]，百合花LrCCoAOMT 参与调节SA 信号水平，使维管束组织中的木质素含量增加并提高对灰霉病的抗性[34]。转录组分析表明，ESP 在侵染叶片36、48 h 后表达量显著降低，CcoAOMT在接种48 h 上调表达，而ESP 和CcoAOMT 如何参与大白菜菌核病的抗性需进一步研究。