复方葶苈子汤治疗慢性肺源性心脏病的作用机制研究*

林婷婷，王慧，张真，伍新诚，管聘，柏正平

1 湖南中医药大学 湖南长沙 410208

2 湖南省中医药研究院附属医院 湖南长沙 410006

慢性肺源性心脏病（chronic pulmonary heart disease；CPHD）是由于呼吸系统疾病（包括支气管-肺组织、胸廓或肺血管病变）导致右心室结构和/或功能改变的疾病，其多继发于慢性阻塞性肺疾病，病程久，易反复发生，预后不佳，病死率高，给社会带来了沉重的负担。肺心病属于中医“肺胀、喘证、水肿”等范畴，《丹溪心法·咳嗽》曰：“肺胀而嗽，或左或右不得眠，此痰夹瘀血碍气而病”。肺心病发病的关键在于“湿胜阳虚”[1]，发病因素早期以痰饮内伏为主，日久痰瘀并重，基于此理论基础并结合长期临床诊疗经验，湖南省名中医柏正平教授创立出治疗CPHD的有效经验方——复方葶苈子汤，该经验方的治疗指导思想为“饮瘀同治”，该方制成的复方葶苈子胶囊已完成前期临床研究[2]，临床研究表明复方葶苈子胶囊对肺心病合并心衰有较好的疗效，其作用机制可能是通过加强心肌收缩力，降低动脉血CO2分压、改善肺通气换气功能、降低血液黏稠度，从而改善肺部血液循环，减轻心脏前负荷来改善心功能，但在完成临床疗效观察的基础上，该方潜在的药效物质基础尚不清楚，且药物的作用靶点、生物途径及作用机制也未阐明。故本文基于网络药理学研究复方葶苈子汤治疗慢性肺源性心脏病的作用机制。

资料与方法

1 “复方葶苈子汤”化学成分及成分靶点的收集和筛选

复方葶苈子汤药物主要由葶苈子、黄芩、桂枝、茯苓、白术、矮地茶、水蛭、地龙这几味药物组成。利用 TCMSP（http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）数据库，搜索出药物的全部活性成分，参照药代动力学的吸收、分布、代谢和排泄（Absorption，Distribution，Metabolism and Excretion，ADME）特性，以口服生物利用度（OB）≥30%、药物类药性（DL）≥0.18为筛选条件，筛选出复方葶苈子汤药物的有效化学成分；由于在TCMSP数据库中未找到水蛭、地龙这俩味药的有效成分，通过文献检索，补充在TCMSP上未检索到的水蛭、地龙两味虫类药的有效成分，通过化源网找到这两味药的CAS号，在pubchem上找到他们的2d结构化学式，先通过SwissADME 数据库平台（http：// www.swissadme.ch/），以胃肠道利用度（GI absorption，GA）为“High”、类药性（Druglikeness，DL）所包含（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）中2项及2项以上为“Yes”筛选条件，筛选出符合的活性成分，然后将其2D Structure导入到 Swiss Target Prediction 数据（http：//www.swisstargetprediction.ch/）检索获得水蛭、地龙成分靶点。最终建立药物有效成分-靶点数据库。

2 慢性肺源性心脏病疾病靶点筛选+交集靶点

在生物信息综合数据库Genecards（https：//www.genecards.org/）数据库中，以“chronic pulmonary heart disease”作为关键词进行检索，获得数据库中信度较高（score≥20）的慢性肺源性心脏病相关靶点，删除重复值后建立慢性肺源性心脏病相关靶点。利用Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在线绘图工具获取交集靶点，绘制韦恩图。

3 构建PPI网络图和“药物-有效成分-交集靶点-疾病”网络图

将交集靶点导入string11.5（https：//cn.string-db.org/）数据库，选择物种为“Homo sapines”进行检索，以score≥0.9为筛选条件，获取蛋白质-蛋白质（PPI）互相作用网络图。将获取的靶点PPI信息图导入cytoscape3.9.1软件绘制“方药-有效成分-交集靶点-疾病图”。

4 GO分析与KEGG通路富集分析，并绘制气泡图

将交集靶点基因信息投射到Metascape（https：//metascape.org）数据库，选择物种 H.sapiens，设置P-value＜0.01 为基因富集临界值，分别进行GO 分子功能（Molecular Functions，MF）、GO 生物过程（Biological Processes，BP）、GO 细胞组成（Cellular Components，CC）、KEGG通路富集分析，获得数据，并通过微生信在线工具（www.bioinformatics.com.cn）将结果分别进行气泡图及柱状图绘制。

结 果

1 “复方葶苈子汤”活性成分的筛选

筛选出复方葶苈子汤各中药化学成分 114 个；对复方葶苈子汤各成分作用靶点进行汇总，删除重复值得到靶点599个。见表1。

2 慢性肺源性心脏病的潜在作用靶点预测及“方药-有效成分-交集靶点-疾病”网络图构建

在Genecards中搜索“chronic pulmonary heart disease”为关键词，取relevance score为＞20，筛选疾病靶点，得到慢性肺源性心脏病靶点为1667个。使用 Venny 2.1在线平台绘制“复方葶苈子汤-慢性肺源性心脏病”交集靶点韦恩图，得到246个共同靶点，见图2。并建立“方药-疾病-交集靶点-疾病”数据库，将数据库文件导入cytoscape软件构建，见图3。

图2 复方葶苈子汤-慢性肺源性心脏病”交集靶点韦恩

图3 方药-有效成分-交集靶点-疾病

3 “ 复方葶苈子汤”与“慢性肺源性心脏病”靶点蛋白相互作用网络（ PPI）的构建

将“药物成分-疾病靶点”数据库文件中的靶点信息导入 STRING11.5网站，并利用cytoscape软件构建 PPI，图中共包含节点245个，边1310条，平均节点度10.7，根据靶点蛋白之间相互作用的平均度值筛选出核心靶点。靶蛋白按度值由高至低依次为：SRC、STAT3、MAPK3、MAPK1、AKT1、HSP90AA1、PIK3CA、TP53、RELA、JUN、EGFR、MAPK14、PTPN11、CREBBP、MAPK8、ESR1、IL6、RHOA、TNF。平均degree值为31。见图4。

图4 “复方葶苈子汤”与慢性肺源性心脏病的PPI网络

4 GO分析及KEGG通路分析

将246个交集靶点输入Metascape软件中，进行GO生物过程分析及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。

GO分析注释结果分析：生物过程 20 个，细胞组成20个，分子功能 20个，生物过程（Biological Process，BP）说明复方葶苈子汤治疗慢性肺源性心脏病与激素反应（response to hormone）、激酶活性的调节（regulation of kinase activity）、蛋白质磷酸化的正向调控（positive regulation of protein phosphorylation）、细胞对氮化合物的反应（cellular response to nitrogen compound）、对外来刺激的反应（response to xenobiotic stimulus）、对细菌起源的分子的反应（response to molecule of bacterial origin）、细胞对脂质的反应（cellular response to lipid）、细胞黏附的调控（regulation of cell adhesion）有关。细胞组成（Cellular Component，CC）涉及膜微结构域（membrane microdomain）、质膜筏（plasma membrane raft）、胞质囊腔（cytoplasmic vesicle lumen）、分泌颗粒内腔（secretory granule lumen）、ficolin-1-rich颗粒（ficolin-1-rich granule）、质膜蛋白复合物（plasma membrane protein complex）、黏着斑（focal adhesion）、细胞基质结（cell-substrate junction）、初级溶酶体（primary lysosome）等。分子功能（Molecular Functions MF）包括蛋白激酶活性（protein kinase activity）、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性（transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity）、生长因子结合（growth factor binding）、血管内皮生长因子受体活性（vascular endothelial growth factor receptor activity）、泛素蛋白连接酶结合（ubiquitin protein ligase binding）、肽链内切酶活性（endopeptidase activity）等分子活性调节。见图5。

图5 GO分析

KEGG信号通路富集分析：筛选得到的前20条信号富集通路，分别是脂质和动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）、c型凝集素受体信号通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、EB病毒感染（Epstein-Barr virus infection）、细胞凋亡（Apoptosis）、IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）、toll样受体信号通路（Tolllike receptor signaling pathway）等通路。见图6。

图6 KEGG富集分析

讨 论

慢性肺源性心脏病（chronic pulmonary heart disease）是由于呼吸系统疾病（包括支气管-肺组织、胸廓或肺血管病变）导致右心室结构和/或功能改变的疾病，肺血管阻力增加和肺动脉高压是其中的关键环节，且其多继发于慢性阻塞性肺疾病[3]，病程久，易反复发生，预后不佳，病死率高，给社会带来了沉重的负担。肺心病属于中医“肺胀、喘证、水肿”等范畴，标，《诸病源候论·咳逆短气候》所云：“肺虚为微寒所伤则咳嗽，嗽则气还于肺间则肺胀……”肺心病以阳虚为本，兼夹痰饮淤血，壅滞肺气，使得肺气胀满不能敛降，而缠绵难愈的根本原因在于“痰饮内伏”，痰饮为湿所化，脾主灌四傍，若脾阳不足以化湿，湿不去，反之耗伤阳气，使阳气愈虚，气不化湿，上聚成痰饮诱发咳喘。《丹溪心法·咳嗽》日：“肺胀而嗽，或左或右不得眠，此痰夹瘀血碍气而病”。饮为阴邪，得温则化，肺气壅滞，无法调畅全身气机，心主血脉，肺虚无法助心行血，导致淤血内阻。故治疗上当从痰饮论治[4]，痰饮的治疗在《金匮要略》中已经明确提出当以温药和之，脾为生痰之源，脾阳虚愈会加重痰湿，多以利小便使湿邪有通路来达到通阳的目的。通阳化湿的同时兼以活血祛瘀，结合仲景最早提出的“血不利则为水”理论[5]，“血不利”血不利代表的是血液运行受阻、血行不畅、血液淤积予血脉或是脏器之内的各种淤血状态，瘀血阻滞脉络，血不循经，津液溢出脉外，水液潴留，便形成水肿。复方葶苈子汤由葶苈大枣泻肺汤和苓桂术甘汤加减化裁而成，痰饮上壅胸膈，直阻肺气，不令下降，呼息难通，非用急法不可。葶苈子，味苦、辛、性寒，入足太阳膀胱经，能破气滞而定喘，泻停水而宁嗽，其苦寒迅利，行气泻水，决壅塞而排痰饮，破凝瘀而通经脉，凡停痰宿水、嗽喘肿胀之病，甚奏奇功，《医宗金鉴》中载道：“治肺痈不得卧，及水饮攻肺喘急者”；黄芩清热化痰，止咳平喘，宣肺降气平喘；苓桂术甘汤方出自张仲景的《伤寒杂病论》，是“病痰饮者，当以温药和之”的代表方剂，《绛雪园古方选注》道：此太阳、太阴方也。膀胱气钝则水蓄，脾不行津液则饮聚。白术、甘草和脾以运津液，茯苓、桂枝利膀胱以布气化。崇土之法，非但治水寒上逆，并治饮邪留结，头身振摇，重用茯苓，其甘淡性平，归脾，膀胱，心肺诸经，甘能补脾，淡能渗湿，能使水饮从小便而出；湿淫所胜，小便不利，淡味渗邪，阳也。治水缓脾，生津导气，桂枝辛甘温，有助通心阳和温通经脉的作用，为温阳化气以行水，下气降逆之要药。茯苓甘淡利水，行肺之治节，养心安神，补土制水；桂枝即可温阳化气，又可平冲降逆，苓、桂相伍，温利并用，共奏温阳化饮之效。饮之生成与脾阳不足密切相关，故用苦温而燥的白术，振奋脾阳，运脾燥湿，脾阳振奋，又可助肺阳之输布，肾阳之温化，心阳之温煦，则痰饮无所停留；矮地茶，性平，味苦，辛、归肺、肝经，结合现代药理研究[6]，矮地茶可减少试验性气管炎杯状细胞的增生程度，使痰液减少，并可加速炎症细胞浸润的恢复，从而改善肺气肿；活血化瘀法应贯穿治疗始终，虫类药其性搜剔，可入里入络改善络脉循环，促使痰化饮消；功善走窜，直达病所，宣畅络脉气机，祛除络脉中的血瘀，其疗效非草木植物药可比。正同《医学衷中参西录》中道：“其走窜之性无微不至，故能宣通脏腑、贯彻经络、透达关窍，凡血凝、血聚为病皆能开之。”水蛭活血化瘀，可助肺宣畅气机，地龙通络平喘兼利尿，使药效直达病所，“饮瘀同治”之法，饮去则痰无以生，瘀去则络得通畅，同时已有实验证实复方葶苈子汤多方面、多靶点减轻肺小动脉痉挛、扩张肺血管，降低肺动脉压力从而改善症状[7]。

本研究从复方葶苈子汤中中筛选出槲皮素（quercetin）、鸟嘌呤（Guanine）、水蛭素A（Hirudinoidine A）、苯丙氨酸（Phenylalanine）、木蝴蝶素a（oroxylin a）有效成分，其中槲皮素属于黄酮类化合物，药理特性宽泛[8]。研究表明，氧化应激可直接引起肺组织损伤，促进肺部炎症反应，进一步加重蛋白酶-抗蛋白酶失衡及气道黏液高分泌。槲皮素具有良好的抗氧化活性，可以直接清除氧化应激产生活性氧（ROS），保护生物被膜，提高清除ROS的酶活性，同时螯合金属离子Fe、Cu等抑制ROS产生。同时槲皮素能使炎症因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-9等显著降低，从而减轻肺部炎症细胞浸润，并通过抑制p50、p65、ERK1/2和JBK1/2等磷酸化，抑制NF-κB和MAPK信号通路发挥抗炎作用，降低氧化应激刺激对肺部损伤[9-10]。

PPT网络结果分析提示SRC、AKT1、HSP90AA1、PIK3CA、EGFR、MAPK14、PTPN11、CREBBP、MA为复方葶苈子汤治疗慢性肺源性心脏病的核心靶点，SRC激酶[11]是具有酪氨酸蛋白激酶活性的蛋白质，其在细胞增殖、分化等细胞进程中发挥重要作用，SRC的活化参与各种气道炎症反应的诱导机制，包括活化EGFR诱导STAT3信号转导，增加细胞因子和趋化因子的表达，激活p38 MAPK和NF-kB通路等。研究表明[12]抑制SRC活化可以抑制MMP-9和MMP-12的诱导以及肺内CTSK、IL-17、TNF-α、MCP-1和KC的表达，从而抑制气道炎症和肺组织破坏。

通过 KEGG 富集分析得到分别是脂质和动脉粥样硬化（Lipid and atherosclerosis）、c型凝集素受体信号通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、EB病毒感染（Epstein-Barr virus infection）、细胞凋亡（Apoptosis）、IL-17信号通路（IL-17 signaling pathway）、toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）等通路，TNF是一种参与全身炎症的细胞信号蛋白，有多种下游传导途径，通过激活NF-κB、c-Jun、MAPK通路及Caspase酶联级反应等引起各种经典促炎细胞因子的表达、诱导细胞凋亡。有研究表明[13]，降低TNF-α水平能有效减轻气道炎症反应，抑制黏液高分泌，改善患者气流受限程度。IL-17主要由Th17细胞分化，是其主要的效应细胞，在早期炎症反应中，可进一步促进TNF-α、IFN-α等炎症因子分泌，加剧炎症反应，诱导细胞凋亡，推动疾病进展[14]。综上所述，本研究采用网络药理学探索复方葶苈子汤治疗慢性肺源性心脏病的主要成分、作用靶点及信号通路，从分子机制角度证实了复方葶苈子汤治疗慢性肺源性心脏病的有效性。