宏基因组二代测序在儿童血液肿瘤合并感染中的应用

钟珊 杨明华

（中南大学湘雅三医院儿科/湖南省儿童肿瘤性疾病临床医学研究中心，湖南长沙 410013）

近年来随着分层化疗、免疫治疗、分子靶向治疗、造血干细胞移植等技术的出现，儿童血液肿瘤疾病的生存率有了极大改善，但仍有部分患儿死于治疗相关并发症，其中半数以上与感染相关［1］。血液肿瘤患儿是感染性疾病的易感人群，易发生血液、肺部等多部位、多种病原体的混合感染［2］。微生物培养被认为是病原体诊断的“金标准”［3］，但易受菌量、培养条件影响，阳性率低、耗时长，且不能检测病毒类病原体。其他传统检测手段如抗原/抗体检测和聚合酶链反应检测等，通常病原体检测种类有限，不能满足临床需要。病原体诊断未明情况下经验性抗生素的应用一定程度上助长了耐药菌的产生［4］，由此带来了住院时间延长、住院费用增加等一系列问题。

病原体的早期识别可指导临床个性化用药，及时有效的药物调整对改善血液肿瘤合并感染患儿的预后有重要作用。近年来，一种新兴的病原体检测方法宏基因组二代测序（metagenomic nextgeneration sequencing，mNGS）逐渐发展起来，具有覆盖面广、通量高、检测时间短、测序结果准确等优点，可以无偏移地检测数十种临床样本中的所有潜在病原体，包括细菌、病毒和真菌［5］。mNGS的出现，弥补了传统检测手段的不足。2019年12 月一种不明原因的呼吸道疾病在我国武汉广泛传播，对公共卫生健康构成了重大威胁，通过mNGS 对感染患者的支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）进行测序分析，最终明确病原体为新型冠状病毒［6］。许苗苗等［7］报道了利用mNGS成功诊断1例艾滋病患者肺新生隐球菌合并卡氏肺孢菌感染的病例，体现了mNGS对临床精准治疗的价值，展示出mNGS在诊断罕见、新类型病原体感染及混合感染方面的极大优势。mNGS在检验效能方面的巨大潜力，使其越来越广泛的被应用于血流感染、中枢神经系统感染、关节感染等器官系统的感染诊断中［8］。目前，有共识推荐mNGS应用于免疫受损继发感染者［9］，但针对此类儿童的相关研究不足。本研究通过比较分析mNGS与微生物培养结果，评估mNGS在血液肿瘤患儿感染性疾病病原体诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2020年6月—2022年7月于中南大学湘雅三医院收治的因感染行微生物培养及mNGS的血液病或肿瘤患儿为研究对象。纳入标准：（1）年龄＜15岁；（2）骨髓穿刺、组织病理学检查等实验室检查支持诊断的血液病或肿瘤性疾病，接受过药物化疗、免疫抑制剂或糖皮质激素治疗者；（3）具有发热（体温＞38℃）、畏寒、咳嗽、咳痰、呕吐、抽搐、腹泻等临床表现，不能用非感染原因解释的血常规、降钙素原、C反应蛋白等炎症指标明显升高和/或影像学检查证实存在感染者；（4）同时行微生物培养及mNGS 者。排除标准：（1）最终临床诊断为非感染性疾病者；（2）病历资料不完整者；（3）标本培养结果判定为污染者。本研究获得我院伦理委员会批准（批准号：快I 22263），豁免知情同意。

1.2 临床资料收集

收集43 例患儿的年龄、性别、基础疾病、主要临床症状、实验室指标（白细胞计数、C反应蛋白、降钙素原）、是否入住重症监护室、是否出现脓毒症休克、住院时长、总体疗效等临床资料。

1.3 病原学检测

收集所有患儿的外周血、BALF、脑脊液、骨髓、脓拭子标本，同时送微生物培养及mNGS。部分患儿送检了以下传统病原体检测：病原体抗体血清学检测（肺炎支原体、肺炎衣原体、结核杆菌），鼻拭子呼吸道病毒7 种抗原测定（腺病毒、流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒1 型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、呼吸道合胞病毒），外周血或尿液EB病毒、巨细胞病毒、多瘤病毒聚合酶链反应检测，外周血或BALF的β-D-葡聚糖试验（G试验），半乳甘露聚糖抗原试验（GM试验）。mNGS 样本处理后使用DNA 提取试剂盒（德国Qiagen 公司/中国Magen 公司） 提取DNA。用QIAseq Ultralow Input Library Kit （Illumina） 或NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit（Illumina）构建DNA文库。纯化后，使用Qubit（Thermo Fisher）和Agilent 2100 生物分析仪评估文库质量，然后在Nextseq 550 平台（Illumina，美国）上进行测序。从原始数据中删除短或低质量的读数，通过人类参考数据库滤去人源性序列，并与美国国家生物技术信息中心微生物基因组数据库（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes）对比，获取所有可能病原体的种类及相对丰度信息。根据患儿的临床表现、其他传统病原体检测结果及药物治疗反应，综合判断mNGS 报告的病原微生物是否与临床症状相关。

1.4 统计学分析

采用SPSS 25.0 软件进行统计分析。偏态分布的计量资料用中位数（四分位数间距）［M（Q1，Q3）］表示。计数资料采用例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher 确切概率法或McNemar's检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患儿的临床资料

共纳入符合标准的患儿43 例，其中男性25例，女性18例，中位年龄7.0（3.8，12.1）岁。粒细胞缺乏患儿占56%（24/43）。急性淋巴细胞白血病24例；急性髓系白血病10例；噬血细胞综合征3 例；再生障碍性贫血2 例；其他肿瘤4 例，其中淋巴瘤1例，颅内肿瘤3例。所有患儿送检前均有抗生素用药史，其中7 d以上用药史者占47%（20/43）。主要临床症状为发热（91%）、呼吸道症状（54%）、消化道症状（19%）、神经系统症状（7%）。实验室检查：白细胞计数为1.55（0.18，5.12）×109/L，C反应蛋白为71.30（6.38，103.91）mg/L，降钙素原为0.25（0.12，1.06）ng/mL。

2.2 mNGS与微生物培养法病原体检出情况

43例患儿共送检mNGS标本54份，其中外周血34份，BALF 13份，脑脊液5份，脓拭子1份，骨髓1 份。54 份送检标本中mNGS 共检出40 种病原体。mNGS在外周血中最常检出的细菌、真菌分别为铜绿假单胞菌、热带念珠菌；在BALF中最常检出的细菌、真菌为肺炎链球菌、耶氏肺孢子菌。见表1。微生物培养法在外周血中共检出9种细菌和2种真菌，共17株；最常见的细菌和真菌分别为铜绿假单胞菌和热带念珠菌。在BALF中微生物培养共检出4种病原体，共4株，均为细菌。见表2。

表1 mNGS病原体检出情况 ［n（%）］

表2 微生物培养法病原体检出情况 ［n（%）］

2.3 mNGS 与微生物培养法在不同类型标本的检出率

mNGS在外周血、BALF及其他标本（脑脊液、脓拭子、骨髓）的病原体阳性检出率分别为74%（25/34）、92%（12/13）、86%（6/7），不同标本的检出率差异无统计学意义（P=0.574）。血培养、BALF 培养及其他标本（脑脊液、脓拭子、骨髓）培养的病原体阳性率分别为38%（13/34）、23%（3/13）、0（0/7），差异无统计学意义（P=0.428）。mNGS的病原体总检出率（80%，43/54）高于微生物培养法（30%，16/54），差异有统计学意义（P＜0.001）。相同类型标本中，mNGS 的检出率均明显高于微生物培养法，差异有统计学意义（均P＜0.05）。见表3。54份标本中，mNGS与微生物培养法均阳性者14份，其中5份（36%，5/14）两种检测方法检出的病原体一致，且mNGS检出更多的病原体；另外9 份（64%，9/14）两种方法检出的病原体完全不一致。见表4。

表3 mNGS与微生物培养法在不同类型标本的检出率比较 ［n（%）］

表4 mNGS及微生物培养法均阳性患儿病原体匹配情况 （n=14）

2.4 mNGS与微生物培养法对混合感染的检出率

mNGS 检出2 种或2 种以上的病原体感染者占48%（26/54），微生物培养法占9%（5/54），两者比较差异有统计学意义（χ2=19.95，P＜0.001）；mNGS 及微生物培养法检出2 类或2 类以上的病原体感染的比例分别为33%（18/54）和2%（1/54），两者比较差异有统计学意义（χ2=18.45，P＜0.001）。见表5。

表5 mNGS与微生物培养法对混合感染检出率比较［n（%）］

2.5 mNGS与微生物培养法对不同致病菌的检出率

mNGS真菌检出率高于微生物培养法，差异有统计学意义（χ2=13.30，P＜0.001）。微生物培养法与mNGS 对细菌的检出率比较差异无统计学意义（χ2=0.407，P=0.523）。见表6。

2.6 mNGS 及微生物培养法检测的病原体感染类型

54 份标本中mNGS 阳性43 份，分别为外周血25 份、BALF 12 份、脑脊液4 份、脓拭子1 份、骨髓1份。其中18份（42%，18/43）检出2类或2类以上的病原体感染。mNGS最常检出的感染类型为病毒感染（33%，14/43），其次为真菌合并病毒感染（19%，8/43）。见图1。微生物培养法阳性标本16份，分别为血培养13份、BALF培养3份，最常见检出的感染类型为细菌感染（81%，13/16），其次是真菌感染（12%，2/16）。

图1 mNGS检出的病原体感染类型（n=43）

2.7 mNGS检测与临床治疗

43 例患儿中，mNGS 阳性35 例（81%），阴性8例（19%）。mNGS阳性患儿中，17例（49%，17/35）根据结果调整治疗，其中15例好转出院，1例因肿瘤进展家属放弃治疗，1例因感染合并多器官功能衰竭死亡；另18 例mNGS 阳性患儿因当前使用的药物抗菌谱覆盖了检出的阳性病原体，故未调整治疗，其中15例好转出院，3例因重症感染死亡。8 例mNGS 阴性患儿均未调整治疗，其中3 例为粒细胞缺乏患儿且感染症状持续，5例其他检测检出病原体或者影像学明显异常，最终均好转出院。

3 讨论

血液肿瘤患儿尤其在化疗后常有不同程度的免疫抑制，感染为其常见并发症，也是其不良预后的重要因素，早期、快速、准确地识别病原体及有效的药物治疗对其意义重大。传统病原学检测在很多情况下不能明确病原体，目前已有应用mNGS协助感染性疾病病原体诊断优于微生物培养法的多项研究［10-11］。本研究旨在分析比较mNGS与微生物培养法的病原学特征、检出率，探讨mNGS在血液肿瘤患儿合并感染时对病原体诊断的应用价值。

血液肿瘤患儿发生血流感染不少见，尤其是对于合并严重粒细胞缺乏患儿，其死亡风险明显增加［12］。过去认为革兰阳性菌为肿瘤患者血流感染的主要致病菌，近年来致病菌谱逐渐发生改变，革兰阴性菌在该类患者血流感染中扮演着重要角色［4］。本研究中，mNGS在外周血最常检出的细菌为革兰阴性菌，铜绿假单胞菌最多见，最常见的真菌为热带念珠菌，与血培养的常见病原体一致。从侧面说明了mNGS作为一种补充手段，可与微生物培养法相互验证。一项纳入144例血液肿瘤患者的病原学研究结果显示，所有致病菌中革兰阴性菌占45.8%，革兰阳性菌占39.6%，真菌占14.6%，铜绿假单胞菌是最常见的革兰阴性菌，其次是大肠杆菌，最常检出的真菌是念珠菌属，以热带念珠菌最多见［13］，本研究结果与之一致。本研究mNGS 在BALF 中检出最常见的细菌、真菌、病毒分别为肺炎链球菌、耶氏肺孢子菌、巨细胞病毒及人类疱疹病毒1 型。这与Wang 等［14］应用mNGS检测55 例恶性血液病患儿的肺部感染性病原体研究结果一致。然而，遗憾的是本研究的BALF中未培养出真菌病原体，可能与送检BALF 的病例数过少有关。在这类感染患儿未获得病原学证据前，不同部位的病原谱特点给我们经验性抗感染治疗方案的选择提供了一个方向。

Ren 等［15］对193 例脓毒症患者的研究结果显示，mNGS 检出率为84.6%，微生物培养法检出率为30.5%。本研究mNGS 总检出率为80%，微生物培养为30%，与上述研究结果［15］基本一致。微生物培养法的低检出率可能与本研究纳入的患儿送检前均有抗生素用药史有关，而mNGS检测受抗生素影响小［16］。但在送检mNGS 的外周血、BALF 等标本间检出率没有显著差异，在微生物培养标本间亦如此，这与Miao等［16］的研究结果一致。本研究mNGS 及微生物培养法均阳性的14 份标本中，有9 份（64%，9/14）检出的病原体完全不一致，高于既往一项回顾性研究报道［15］。这可能与单中心数据量不足有关，同时单独应用mNGS检测或者仅使用微生物培养法都可能会遗漏掉部分病原体，两者联用则可能获得更高的检测效能，为临床治疗提供更多有益的信息。

既往报道血液肿瘤患儿免疫力低，15%左右的感染为混合感染［2］。本研究结果显示mNGS 对2种或2种以上病原体感染的检出率高于微生物培养法，mNGS 对2 类或2 类以上病原体感染的检出率亦高于微生物培养法。这与既往研究结果一致［17］。本研究结果显示mNGS对真菌的检出率优于微生物培养，这与Tao 等［18］的研究结果一致。侵袭性真菌病常见于危重症患儿及免疫抑制患儿，病死率高，因预防性抗真菌药物的使用，常规微生物培养多呈现假阴性结果。本研究有1例急性淋巴细胞白血病患儿在诱导化疗第5天开始出现咳嗽，第11天出现反复高热，BALF 培养结果为阴性，但mNGS检出烟曲霉、耶氏肺孢子菌，结合患儿肺部影像学、GM 试验结果，最终确诊为侵袭性真菌病，在静脉滴注卡泊芬净的基础上加用复方磺胺甲噁唑口服及两性霉素B雾化，经调整治疗后患儿临床症状渐好转，复查影像学实变影改善，这得益于mNGS快速准确的检测结果为临床诊断及治疗提供了依据。然而mNGS在检出细菌方面未表现出优势。

本研究中mNGS 检出感染类型主要为病毒感染，其次是真菌合并病毒感染、细菌感染。本研究纳入患儿半数以上为粒细胞缺乏患儿，目前国内外均推荐对于严重粒细胞缺乏及预计粒细胞缺乏时间长者经验性使用氟喹诺酮类、唑类药物治疗［19-20］，故多数患儿在感染症状出现之前，就已启动感染预防措施。

本研究mNGS 检测阳性的患儿中只有17 例（49%）调整治疗，最终仅15例患儿根据结果调整治疗并获益，这低于既往研究报道［10］，另外少数患儿检测结果阴性，均未调整治疗，但患儿最终均好转。未检出病原体情况下多数可排除感染，但需除外某些病原体含量少、核酸提取困难的病原体［5，9］，mNGS指导临床需结合患儿的临床症状、实验室结果及影像学检查等综合考虑，才能作出最佳的临床决策。

然而，本研究也存在局限性：首先，本研究为单中心回顾性研究，病例数有限，结果可能存在一定偏倚，未来期待更大样本量的多中心研究；其次，目前业内对mNGS 结果解释尚无统一标准，本研究对mNGS 的结果判读上可能存在一定主观性。

总的来说，mNGS对比微生物培养法在一些方面仍具有一定优势，如更高的检出率，识别混合感染等，可作为微生物培养法的补充，协助临床诊断，改善患儿预后，对于常规抗感染无效的血液肿瘤患儿及疑难病例建议尽早行mNGS检测。