姜酚纯化前后对胰脂肪酶抑制活性、抗氧化活性比较研究

徐菁， 王秀芬， 刘晓燕，2*

（1.贵阳学院食品与制药工程学院，贵阳 550005； 2.贵阳学院贵州省果品加工工程技术研究中心， 贵阳 550005）

小黄姜（Zingiber officinaleRoscoe）别名穿地龙，姜科姜属植物，切面呈纯黄色，辛辣味较浓，纤维较细[1]，是一种传统的药食两用植物，姜酚是姜中具有生物活性的天然酚类化合物，主要包括6-姜酚、8-姜酚等[2]，其中6-姜酚含量最高。姜酚具有降血糖血脂、抗肿瘤、抗氧化、抑菌、降血压等多种生理活性[3]。目前对姜酚生理活性研究多集中于生姜姜酚粗提物[4-5]，但姜酚粗提物中含有许多杂质，会间接影响其生理活性，鉴于此，研究姜酚的分离纯化对提高姜酚的利用附加值具有重要意义。

目前已有的分离纯化姜酚技术主要有超临界流体萃取[6]、柱层析法[7]等。但这些方法复杂、耗时、试验成本高。大孔吸附树脂是新型高分子聚合物，具有吸附性好、稳定性好、环保、操作简便等优点，故选择大孔树脂法对姜酚进行初步分离纯化。不同型号的大孔树脂极性大小不同，对姜酚的吸附分离效果也不同，本研究采用4种不同极性的树脂NKA-9（极性）、AB-8（弱极性）、D4020（非极性）和D101（非极性）对姜酚进行纯化分离，并对其最佳纯化工艺进行探讨，比较姜酚纯化前后对猪胰脂肪酶的抑制效果和抗氧化能力，为小黄姜姜酚的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂 本研究所用试验材料为小黄姜姜酚粗提物冻干粉。

主要试剂：6-姜酚标准品（C10089550）购自上海麦克林生化科技有限公司；8-姜酚（No.718A022）、10-姜酚（No.718A022）标准品购自北京索莱宝科技有限公司；大孔树脂AB-8、D101、NKA-9、D4020购自天津市光复精细化工研究所；猪胰脂肪酶（CASNo:53608-75-6) 购自上海源叶生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器设备 RC-FA-C型电子分析天平，北京瑞诚永创科技有限公司；TPL15型高速冷冻离心机，长沙安泰仪器有限公司；PU-ST-3C型pH计，湖北康电科学仪器有限公司；N-FC-104型旋转蒸发仪，浙江凯敏仪器有限公司；LC-20A型高效液相色谱仪，日本岛津公司。

1.2 试验方法

1.2.1 大孔树脂的预处理 取NKA-9、AB-8、D4020和D101共4种型号的大孔树脂，用无水乙醇浸泡24 h后用蒸馏水冲洗至无味；先用5% HCl溶液浸泡树脂8 h，蒸馏水反复冲洗至中性，后用5% NaOH溶液浸泡树脂8 h，蒸馏水反复冲洗至中性，50 ℃烘干备用。

1.2.2 树脂静态吸附与解吸动力学研究 精密称量经预处理后的4种型号树脂各3 g于锥形瓶内，分别加入50 mL质量浓度为0.55 mg·mL-1的小姜酚粗提液，于摇床112 r·min-1条件下振荡吸附，1 h取样测定1次姜酚浓度（C1），共测定10次，绘制4种树脂的静态吸附动力学曲线，达到平衡后，用蒸馏水反复冲洗4种吸附饱和树脂，直至流出液无杂质，用50 mL 95%乙醇溶液进行振荡洗脱，1 h取样测定1次姜酚浓度（C2），绘制4种树脂静态解吸动力学曲线。从吸附和解吸2方面，确定最佳大孔树脂型号。

参照刘军伟等[8]方法，以香草醛质量浓度为X轴、吸光度为Y轴，得到标准曲线的回归方程为：

y=0.0624x-0.1266，相关系数R2=0.998，由此标准曲线方程计算姜酚质量浓度。

式中，C0为初始姜酚质量浓度（mg·mL-1）；C1为上样液过柱吸附后流出液中的姜酚质量浓度（mg·mL-1）；C2为解析液洗脱吸附树脂后流出液中姜酚的质量浓度（mg·mL-1）；V1为粗提液体积（mL）；V2为洗脱液体积（mL）；M为树脂质量（g）。

为了更好的描述上述吸附过程，采用准一级动力学模型、准二级动力学模型和颗粒内扩散模型对静态吸附动力学试验数据进行分析论证。

准一级动力学模型如下。

准二级动力学模型如下。

颗粒内扩散模型如下。

式中，Qe为树脂对姜酚吸附平衡时的吸附量（mg·g-1）；Qt为t时刻树脂吸附量（mg·g-1）；K1、K2为动力学参数；Kd为颗粒内扩散模型的吸附速率常数；C为颗粒内扩散模型的常数（mg·g-1）。

1.2.3 树脂静态吸附等温线 分别在25、30、35 ℃恒温摇床中，精确称量3 g最佳树脂于锥形瓶内加入50 mL不同质量浓度的粗提液，使其振荡至饱和吸附后，测定不同恒温条件下上清液中姜酚的质量浓度，以上清液姜酚质量浓度作为横坐标，以吸附平衡时的吸附量作为纵坐标绘制树脂等温吸附曲线，同时利用Langmuir、Freundlich吸附模型，得出相应等温吸附方程。

Langmuir等温吸附公式如下。

Freundlich吸附模型公式如下。

式中，Ce为吸附稳定后流出液中姜酚的质量浓度（mg·mL-1）；Qe为吸附稳定时的吸附量（mg·g-1）；Qm为最大吸附量（mg·g-1）；Ka为朗格缪尔（Langmuir）方程中大孔树脂和多酚作用力强弱的系数，Kb为弗兰德里希（Freundlich）方程中与大孔树脂吸附量相关的系数。

1.2.4 AB-8树脂动态吸附和解吸条件优化 吸附条件的优化：称取树脂11 g，湿法装柱，考察不同上样质量浓度（0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mg·mL-1）姜酚粗提液对吸附率的影响。在最佳上样质量浓度条件下，采用NaOH和HCl调上样液pH，考察上样液不同pH（4、5、6、7、8）对吸附率的影响。在最佳质量浓度和pH条件下，将上样液分别以1.0、1.5、2.0 mL·min-1的流速上柱，按每管5 mL收集流出液，分别测定每管流出溶液的姜酚质量浓度。

解吸条件的优化：吸附完毕后，用蒸馏水反复冲洗柱子去除杂质，冲洗液为无色透明时用乙醇溶液进行洗脱，分别选择体积分数为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，控制1.5 mL·min-1洗脱流速，对吸附饱和后的树脂进行洗脱，直至洗脱完全，收集洗脱液，测定姜酚质量浓度，计算各自解吸率。以最佳乙醇体积分数，分别以1.0、1.5、2.0 mL·min-1的洗脱速度过柱解吸，每次收集流出液5 mL为1管，测定各管流出液的姜酚质量浓度。

1.2.5 小黄姜姜酚纯度效果检验 纯化前后纯度测定：将小黄姜姜酚粗提液及纯化后的洗脱液减压蒸馏除去溶剂，冷冻干燥后得小黄姜姜酚粗品与精制品，分别准确称取80 mg，无水乙醇定容至50 mL，即为测试液，测定多酚质量浓度，采用下面公式计算粗多酚与精制多酚的纯度。

式中，C为根据香草醛标曲[9]计算得到的姜酚质量浓度（mg·mL-1）；V为溶液体积（mL）；m多酚质量（g）；n为稀释倍数。

高效液相色谱法测定纯化前后6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚含量。色谱条件：流动相A（0.1%磷酸水）-流动相B（乙腈）；柱温30 ℃；流速0.7 mL·min-1；检测波长280 nm，流动相洗脱方法见表1。准确称取6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚对照品20 mg，用60%甲醇溶液定容至10 mL容量瓶，分别以3种姜酚对照品质量浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到3种姜酚标准曲线方程分别为：y=4235124x+220589，R2=0.9988（6-姜酚）；y=8698048x+3413，R2=0.9972（8-姜酚）；y=900412x+1546.5，R2=0.9981（10-姜酚）。根据绘制的标准曲线计算纯化前后3种姜酚含量。

表1 高效液相色谱法梯度洗脱程序Table 1 HPLC gradient elution schedule

1.2.6 抗氧化活性的研究 还原能力的测定参照巫永华等[10]的方法；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）自由基清除能力的测定参照谭敏华等[11]的方法；2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2，2-diazo-bis (3-ethyl-benzothiazole-6-sulfonic acid)diammonium， ABTS]自由基清除能力的测定参照任旭等[12]的方法；羟基自由基清除能力测定参照刘文颖等[13]的方法。以上测定方法按吸光度大小合理范围，试剂略微调整。

1.2.7 胰脂肪酶活性测定 参照裴文清等[14]方法并做调整，各反应物剂量见表2，依次加入pH 8.0的Tris-HCl缓冲液、抑制剂溶液和酶溶液，混合均匀，于37 ℃培养箱恒温反应10 min后，加入底物溶液对硝基苯磷酸二钠六水合物（p-nitropheny/phosphate， PNPP）在相同反应条件下反应20 min。最后于405 nm处测定其吸光值，计算各样品对胰脂肪酶的抑制率，阳性对照为奥利司他，计算公式如下。

表2 反应体系各溶液加入量Table 2 Amount of each solution in the reaction system（µL）

式中，A1为样品组；A0为样品对照组；B1为对照组；B0为空白对照组。

1.3 数据分析与处理

所有试验重复3次，数据采用Origin 8.5绘图，用SPSS 25.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 树脂静态吸附-解吸动力学研究结果

2.1.1 静态吸附动力学曲线绘制 由图1可知，4种型号树脂在1～3 h时树脂吸附量增幅较大，3～5 h时树脂吸附量增幅逐渐平稳，5 h时树脂吸附基本达到饱和状态。以平衡时吸附量Qe为指标，4种树脂吸附能力的大小顺序一致为AB-8＞D101＞D4020＞NKA-9，说明树脂AB-8对姜酚的吸附性能较好，相比其他3种树脂来说更适合于姜酚的纯化。

图1 AB-8、D101、D4020和NKA-9树脂静态吸附动力学曲线Fig. 1 AB-8、D101、D4020 and NKA-9 resin static adsorption kinetic curve

采用颗粒内扩散模型、一级和二级动力学模型对动力学曲线试验数据进行分析论证，结果见表3。从表3可知，4种树脂二级动力学模型R2均大于0.998，高于颗粒内扩散模型和准一级动力学模型，且平衡时吸附量Qe值的大小顺序为AB-8＞D101＞D4020＞NKA-9，与图1吸附动力学曲线分析结果一致，说明准二级动力学模型能更好地描述4种树脂对小黄姜姜酚吸附过程。

表3 AB-8、D101、D4020和NKA-9大孔树脂多酚吸附动力学方程和参数Table 3 Adsorption kinetic equations and parameters of polyphenols on AB-8， D101， D4020 and NKA-9 macroporous resins

2.1.2 静态解吸动力学曲线绘制 由图2可知，4种树脂在2 h后基本达到终点，且平衡时解吸量的大小顺序为 AB-8＞D101＞D4020＞NKA-9，解吸量排序同吸附量一致，因此从静态吸附和解吸2方面考虑，筛选出AB-8大孔树脂最佳。

图2 AB-8、D101、D4020和NKA-9树脂静态解吸动力学曲线Fig. 2 AB-8、D101、D4020 and NKA-9 resin static desorption kinetic curve

2.2 树脂静态吸附等温曲线绘制

吸附等温线有助于了解吸附剂与吸附质之间的相互作用，优化性能参数和节约能源[15]。由图3可知，在25～35 ℃范围内，随着温度的逐渐升高，平衡时的吸附量依次降低，说明在高温条件下，吸附质容易向吸附剂表面迁移，导致温度和吸附量成反比，由此可知吸附温度在25 ℃时能更有效从样液中吸附吸附质。

图3 AB-8大孔树脂吸附等温线Fig. 3 Adsorption isotherm of AB-8 macroporous resin

分别利用Langmuir和Freundlich方程对试验数据进行拟合，考察AB-8大孔树脂对小黄姜姜酚吸附数据与2种热力学模型的拟合程度，分别得到相应的热力学方程及参数，从表4和表5中可以看出，在25～35 ℃时，随着温度的升高，Ka、Qm逐渐降低，与吸附等温线结论一致。Langmuir等温方程的R2值均大于Freundlich等温方程，表明Langmuir等温方程对AB-8大孔树脂对小黄姜姜酚等温吸附过程的描述更合适。

表4 Langmuir 等温吸附方程及相关参数Table 4 Langmuir isothermal adsorption equation and related parameters

2.3 AB-8树脂动态吸附条件的优化结果

2.3.1 上样量优化 由图4可知，姜酚质量浓度为0.80～1.60 mg·mL-1时，吸附率呈上升趋势，当上样质量浓度大于1.60 mg·mL-1时，吸附剂吸附逐渐饱和，部分吸附质未被吸附就流出，导致吸附率下降[16]，综合考虑，选择1.60 mg·mL-1为最佳上样质量浓度。

图4 上样质量浓度、pH、流速对吸附效果的影响Fig. 4 Effect of sample mass concentration ， pH and flow rate on adsorption effect

2.3.2 pH、流速对吸附效果的影响 树脂的吸附率随小黄姜姜酚上样液pH的升高呈先上升后下降趋势，当pH＞4.0时，树脂的吸附率降低，表明酸性条件能保持多酚的酚羟基结构，更有利于AB-8树脂对小黄姜姜酚的吸附（图4）。因此，小黄姜姜酚上样液最佳pH为4.0。

流出液中的多酚质量浓度为初始上样液多酚质量浓度的1/10时，为树脂的泄漏点[17]。泄漏点越早出现表明上样液流经大孔树脂出现吸附不充分的现象越早，1.0 mL·min-1上样流速时，达到树脂吸附泄漏点的上样体积为80 mL左右；1.5 mL·min-1上样流速时，达到树脂吸附泄漏点的上样体积为55 mL左右；2.0 mL·min-1上样流速时，达到树脂吸附泄漏点的上样体积为25 mL左右（图4）。鉴于以上结果，得出最佳流速为1.5 mL·min-1。

2.4 AB-8树脂解吸条件的优化结果

由图5可知，当乙醇体积分数增大至80%后，解吸率开始逐渐平缓，乙醇体积分数过大会导致与小黄姜姜酚的极性差距较大，解吸率会降低，部分吸附杂质也会竞争脱附，所以综合考虑确定乙醇体积分数80%为最优。随着解吸剂流速增加解吸效果变差，这是因为在较低解吸流速下解吸剂与树脂接触时间长，解吸下来的姜酚较多。相反，在较高解吸流速下解吸剂与树脂接触时间短，则解析下来的姜酚较少[18-19]。但是在较低解吸速率下生产周期太长，不利于生产。鉴于此，选择中间流速1.5 mL·min-1为最佳解析流速。

图5 解吸剂体积分数和解吸流速对解析效果的影响Fig. 5 Effect of desorption agent volume fraction and desorption flow rate on resolution effect

2.5 AB-8大孔树脂对小黄姜姜酚纯化效果检验

经过AB-8大孔树脂分离纯化后，小黄姜姜酚纯度由之前的24.25%提高到了80.99%，表明AB-8大孔树脂对小黄姜姜酚有较好的纯化作用，能够实现成分的富集。如图6所示，纯化前6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚的含量分别为2.96%、0.28%和0.10%，纯化后3种姜酚含量分别为14.18%、1.67%和0.18%，纯化后3种姜酚的含量明显提高。

图6 样品色谱图Fig. 6 Sample chromatogram

2.6 姜酚纯化前后体外抗氧化试验结果

小黄姜姜酚经AB-8树脂纯化后，纯化物对总还原力、DPPH、ABTS、羟基自由基自由基清除能力高于粗提物（图7）。由此可知酚类化合物经大孔树脂纯化后总酚含量升高导致抗氧化能力增强，这与巫永华等[20]采用AB-8树脂纯化山楂叶多酚的研究结果一致。

图7 姜酚纯化前后对还原力、DPPH、ABTS、羟基自由基清除能力Fig.7 Gingerol before and after purification on reducing power， DPPH， ABTS， hydroxyl radical scavenging ability

2.7 姜酚纯化前后对胰脂肪酶抑制效果

由图8可得出，在0～6 mg·mL-1质量浓度范围内，对胰脂肪酶抑制效果排序为：姜酚粗提物＜姜酚纯化物＜奥利司他，而在较高质量浓度4～6 mg·mL-1范围内，姜酚纯化物对胰脂肪酶的抑制率明显接近于阳性对照奥利司他，说明姜酚纯化物对胰脂肪酶具有较好的抑制效果，姜酚粗提物抑制率（45.6±2.11)%，IC50（拮抗剂的半抑制浓度，值越小说明抑制效果越好）为6.69 mg·mL-1；姜酚纯化物抑制率（60.4±1.83)%，IC50为4.45 mg·mL-1；奥利司他（阳性对照）抑制率（71.17±2.68)%，IC50为3.35 mg·mL-1。

图8 姜酚纯化前后对胰脂肪酶的抑制效果Fig. 8 Inhibitory effect of gingerol on pancreatic lipase before and after purification

3 讨论

3.1 姜酚大孔树脂纯化工艺研究

大孔树脂的选择需根据所分离化合物的结构特征来确定，不同型号的大孔树脂极性不同，对多酚的吸附分离效果也不同，刘军伟等[8]比较了5种不同极性树脂吸附率，得出AB-8更适合于生姜多酚的纯化研究。刘伟等[21]比较了6种不同极性树脂的吸附率、吸附量和解析率，得出D101树脂更适合于6-姜酚的纯化研究。为进一步准确筛选出合适的树脂种类，除考察静态、动态吸附量等指标外，还应进行静态的吸附动力学研究。张沛等[22]在研究大孔树脂纯化黄芪毛蕊异黄酮工艺过程中，除考察静态吸附量和吸附率等指标外，还进行了静态吸附动力学研究，认为仅凭吸附量、吸附率而不考虑动力学吸附特征来评价某种树脂合适与否是不全面的。本研究以小黄姜姜酚粗提物为原材料，对NKA-9、AB-8、D4020和D101共4种树脂进行了静态吸附-解吸动力学研究并绘制静态动力学曲线，在此基础上采用准一级、二级和颗粒内扩散模型对静态动力学曲线数据进行分析论证，并采用解吸量来衡量树脂解析性能，结果表明准二级动力学模型R2值均大于其余2种动力学模型，说明其能更好地阐述4种树脂对小黄姜姜酚的吸附机理，4种树脂对小黄姜姜酚吸附量和解析量大小顺序均为AB-8＞D101＞D4020＞NKA-9，通过静态吸附和解吸2方面筛选出最佳树脂型号为AB-8。

在整个纯化工艺过程中吸附条件和解析条件的选择直接影响树脂吸附性能，影响树脂吸附的因素主要包括上样溶液的质量浓度、上样溶液的pH、上样的流速和体积；影响树脂解吸的因素主要包括洗脱剂的体积百分比、洗脱流速和体积。刘伟等[21]研究D101型大孔树脂纯化姜油树脂中的6-姜酚，上样液质量浓度为2 mg·mL-1，上样流速为2 mL·min-1，以80%乙醇流速2 mL·min-1洗脱，纯化后的6-姜酚纯度从1.54%提高到71.32%。于艳静等[23]研究HPD-950大孔树脂纯化生姜中的6-姜酚，上样质量浓度为2.1 mg·mL-1，pH 6.5，上样流速1 mL·min-1，以65%乙醇溶液流速0.5 mL·min-1洗脱，纯化后的6-姜酚纯度可达34.43%。本研究AB-8大孔树脂的动态吸附-解吸试验结果表明，AB-8树脂动态纯化姜酚最佳条件为上样质量浓度1.6 mg·mL-1，pH 4.0，上样流速1.5 mL·min-1，以80%乙醇溶液流速1.5 mL·min-1洗脱，经纯化后姜酚纯度达到80.99%，高效液相色谱结果表明6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚3种酚类单体物质含量相比纯化前提高了3倍以上，说明AB-8树脂对小黄姜姜酚有较好的分离纯化作用，能够实现成分的富集。

3.2 姜酚纯化前后对胰脂肪酶抑制活性研究及体外抗氧化活性研究

随着生活水平的提高，人们每天获取的热量往往大于消耗的热量，热量进入体内后得不到及时的消耗会引发高血脂症，研究表明，胰脂肪酶是催化脂肪水解的关键酶，抑制其活性可以降低脂肪水解，延缓脂肪被人体所吸收，从而达到降脂的目的。目前，国内对胰脂肪酶抑制活性方面的研究主要集中在天然提取物中的黄酮化合物[24]、多糖[25]、多酚[26]等活性成分上，其中植物多酚对胰脂肪酶的抑制研究较多，但尚未见姜酚对胰脂肪酶抑制活性的相关报道，鉴于此本研究测定了经AB-8大孔树脂纯化后的姜酚纯化物对胰脂肪酶活性的抑制，并与纯化前对胰脂肪酶的抑制活性进行比较，结果表明，纯化后的姜酚对胰脂肪酶的抑制率明显接近于阳性对照奥利司他，说明纯化后的姜酚对胰脂肪酶具有较好的抑制效果。小黄姜姜酚经AB-8树脂纯化后，纯化物对DPPH、ABTS、羟基自由基自由基清除能力明显高于粗提物，说明小黄姜姜酚纯化后具有较强的抗氧化性，具有开发为抗氧化剂的潜力，为小黄姜姜酚进一步开发利用提供了理论依据。