电针调控肿瘤坏死因子受体1/受体相互作用蛋白激酶1/核因子κB轴对骶髓损伤后神经源性膀胱尿潴留大鼠尿动力学的影响

卢壮，刘敏，韦艳梅，黄钰岚，林静

作者单位：百色市人民医院，a康复医学科，b泌尿外科，广西壮族自治区 百色 533000

神经源性膀胱（neurogenic bladder， NB）是骶髓损伤（sacral cord injury， SCI）的常见临床并发症，SCI 病人中NB 的发生率近乎100%，严重影响了病人生存质量［1］。SCI后，受损的神经中枢无法有效调控膀胱逼尿肌及尿道括约肌，极易出现膀胱或尿道功能障碍，最终导致尿潴留，引发反复尿路感染、结石、慢性肾功能衰竭等疾病［2］。电针对神经官能症、神经痛和神经麻痹等疾病具有较好疗效。多项研究结果［3-4］表明，电针疗法具有促进损伤脊髓修复、双向调节膀胱功能及抗泌尿系统感染的独特功效。笔者前期研究已表明，电针取穴“次髎”“中极”“三阴交”可调控凋亡相关因子的表达，使SCI 后NB 模型大鼠的膀胱功能得到改善［3-4］。炎症反应与凋亡关系密切。过度炎症反应可诱发脊髓继发性损伤，加速神经元凋亡，影响SCI 后神经功能的修复以及膀胱功能。研究发现，电针刺激还可通过抑制炎症反应改善大鼠SCI后下肢运动功能［6］，提示电针改善SCI 后NB 大鼠膀胱功能的机制也可能与其抗炎效应有关。故本研究拟选取SCI 后NB 大鼠模型为研究对象，探究电针对SCI后NB 尿潴留大鼠尿动力学及炎症反应的影响及机制。本研究起止时间为2019年1月至2021年12月。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器注射用青霉素钠（石家庄石药集团中诺药业公司，批号H23020930）；乳酸钠林格注射液（安徽双鹤药业公司，批号H20055488）；水合氯醛（上海山浦化工有限公司，批号30037516）；TriQuick Reagent（北京Solarbio 公司）；反转录试剂（武汉Monad 公司）；SYBR qPCR Master Mix（安徽Biosharp 公司）；肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6） ELISA 试剂盒（上海酶联生物）；γ干扰素（IFN-γ）ELISA试剂盒（武汉基因美公司）；肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）、受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）、磷酸化kappa B 抑制因子激酶（p-IKKβ）、kappa B 抑制因子激酶（IKKβ）、核因子κB p65（NF-κB p65）、磷酸化核因子κB p65（p-NF-κB p65）、磷酸化NF-κB 抑制蛋白α（p-IκBα）、β-actin、GAPDH 抗体（英国Abcam 公司）；NF-κB 抑制蛋白α（IκBα）抗体（美国CST 公司）；BCA 蛋白定量试剂盒（北京Solarbio 公司）；RIPA 裂解液（北京Solarbio 公司）；WZ-50C6 微量灌注泵（浙江史密斯医学仪器公司）；SDZ-V 型电针治疗仪（苏州医疗公司）；MP150-WSW 多通道生理记录仪（美国Biopac 公司）；电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；多功能酶标仪（美国MD 公司）；Real-Time PCR System（美国Agilen 公司）；低温离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2 动物及分组SPF 级SD 大鼠45 只，雄性，体质量范围为250~300 g，由广西医科大学实验动物中心提供。采用随机数字表法挑选10 只大鼠作为空白组，其余35 只构建SCI 后NB 尿潴留大鼠模型，2 周后确定SCI 后NB 模型成功后随机数字表法选取30只分为模型组、电针组与电针对照组，每组10 只。动物实验过程符合动物伦理委员会标准。

1.3 动物模型制备采用脊髓横断法并加以改良，构建SCI后NB尿潴留大鼠模型［7-8］：大鼠在手术前禁食12 h；腹腔注射10%水合氯醛（30 mg/kg）麻醉后固定于鼠板上；取大鼠俯卧位，消毒铺巾；以L2~L3椎间隙为中心切开皮肤，分离肌肉和筋膜；切断L2~L3棘间韧带，咬除椎板；用牙科探针挑起并切断脊髓；止血、缝合、消毒。手术后常规喂养，连续腹腔注射7 d 20 万U 青霉素防止感染。手术后，大鼠处于脊髓休克期，膀胱会出现尿潴留，每天手法辅助排尿2~3次。手术后第14天，大鼠度过脊髓休克期后，出现前肢可行走、后肢拖动，膀胱无抑制性收缩、膀胱最大容量明显下降，尿潴留等症状，说明SCI 后NB尿潴留大鼠模型构建成功。

1.4 一般情况观察35 只造模大鼠中，有1 只后肢能自主活动，1只手术后死亡，1只不符合造模要求，共32 只符合造模成功标准，取30 只大鼠随机分为模型组、电针组和电针对照组，每组10只，纳入结果分析。

1.5 电针治疗建模成功2 周后行电针治疗［7，9］。电针组选取穴位：“次髎”“中极”“三阴交”，电针对照组选取上述3 个穴位的对照点（穴外侧旁开0.3 cm 处），两组针刺操作方法相同，20 min/d，连续7 d。空白组和模型组不进行电针治疗。

1.6 尿动力学检测各组大鼠水合氯醛麻醉后排空膀胱，将F3 导管从尿道导入，用微量灌注泵和MP150-WSW 多通道生理记录仪匀速（0.1 mL/min）灌注恒温生理盐水，检测并记录膀胱最大容量（mL）、膀胱基础压（cmH2O）、漏尿点压力（cmH2O）和膀胱顺应性（mL/cmH2O）。

1.7 样本采集和处理各组大鼠完成尿动力学检测后，水合氯醛腹腔麻醉，以L2~L3椎间隙为中心取上下各约l cm 脊髓组织，生理盐水洗净，−80 ℃保存备用。

1.8 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）TRIzol 试剂盒从各组大鼠脊髓组织中提取总RNA，逆转录混合底物逆转录总cDNA。SYBR Green 法进行PCR 扩增，反应体系；95 ℃ 30 s 变性，94 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；均重复3 次，结果取平均值，2−ΔΔCt法计算TNFR1和RIPK1的相对表达量。引物见表1。

表1 引物序列

1.9 蛋白质印迹法（Western Blotting）将大鼠脊髓组织匀浆后，离心取上清液，BCA 法测定蛋白浓度，5×Loading buffer 混匀，沸水浴5 min；提总蛋白，行恒压SDS-PAGE 电泳，转PVDF 膜；TBST 洗涤，5%脱脂奶粉-TBST 37 ℃封闭1 h，加一抗，4 ℃孵育过夜；加对应HRP 标记二抗，37 ℃孵育1 h，TBST 洗涤，ECL 显影，Image J 分析条带，计算TNFR1、RIPK1、p-IKKβ、IKKβ、NF-κB（p65）、p-NF-κB（p65）、p-IκBα、IκBα的相对表达量。

1.10 酶联免疫吸附剂测定法（ELISA）取适量组织块，预冷PBS 冲洗，称重；加预冷PBS（组织与PBS质量体积比为1∶5）于冰上充分研磨；匀浆液5 000×g离心5 min，取上清；严格按说明书检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ含量。

1.11 统计学方法使用SPSS 25.0 和GraphPad Prism 5 进行数据分析和绘图，计量资料表示为xˉ ±s。符合正态分布的数据用参数检验，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t和SNK-q检验；不符合正态分布的数据用非参数检验，多组间比较和组间两两比较用Kruskal-Wallis 检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠尿动力学检测与空白组比较，模型组大鼠膀胱最大容量、膀胱基础压、漏尿点压力、膀胱顺应性增加，差异有统计学意义（P<0.05）；与电针组治疗前比较，电针组治疗后膀胱最大容量、膀胱基础压、漏尿点压力、膀胱顺应性降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与电针对照组治疗后比较，电针组治疗后膀胱最大容量、膀胱基础压、漏尿点压力、膀胱顺应性降低，差异有统计学意义（P<0.05）；电针对照组治疗后与治疗前比较差异无统计学意义（P>0.05）；电针组及电针对照组治疗前与模型组比较均差异无统计学意义（P>0.05）。见表2，3。

表2 大鼠尿动学检测结果/

表2 大鼠尿动学检测结果/

注：①与空白组比较，P<0.05。

?

表3 大鼠治疗前后尿动学检测结果/

表3 大鼠治疗前后尿动学检测结果/

注：①与治疗前比较，P<0.05。②与电针对照组比较，P<0.05。

?

2.2 电针对大鼠脊髓组织TNFR1/RIPK1 通路指标表达的影响与空白组比较，模型组TNFR1、RIPK1 mRNA 和TNFR1、RIPK1、p-IKKβ/IKKβ 和p-IκBα/IκBα 蛋白表达升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，电针组TNFR1、RIPK1 mRNA和TNFR1、RIPK1、p-IKKβ/IKKβ 和p-IκBα/IκBα 蛋白表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）；电针对照组与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表4，5。

表4 各组大鼠脊髓组织TNFR1、RIPK1 mRNA的表达/

表4 各组大鼠脊髓组织TNFR1、RIPK1 mRNA的表达/

注：TNFR1为肿瘤坏死因子受体1，RIPK1为受体相互作用蛋白激酶1。①与空白组比较，P<0.05。②与模型组比较，P<0.05。③与电针对照组比较，P<0.05。

?

表5 各组大鼠脊髓组织TNFR1/RIPK1通路指标蛋白的表达/

表5 各组大鼠脊髓组织TNFR1/RIPK1通路指标蛋白的表达/

注：TNFR1为肿瘤坏死因子受体1，RIPK1为受体相互作用蛋白激酶1，p-IKKβ为磷酸化kappa B 抑制因子激酶，IKKβ为kappa B 抑制因子激酶，p-IκBα为磷酸化NF-κB抑制蛋白α。①与空白组比较，P<0.05。②与模型组比较，P<0.05。③与电针对照组比较，P<0.05。

?

2.3 电针对大鼠脊髓组织NF-κB 通路指标表达及炎症反应的影响与空白组比较，模型组p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表达和TNF-α、IL-1β、IL-6、IFNγ 含量升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，电针组p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白表达TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ 含量降低，差异有统计学意义（P<0.05）；电针对照组与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图1和表6，7。

图1 各组大鼠脊髓组织中NF-κB p65、p-NF-κB p65的表达

表6 各组大鼠脊髓组织NF-κB通路指标蛋白的表达/

表6 各组大鼠脊髓组织NF-κB通路指标蛋白的表达/

注：NF-κB p65 为核因子κB p65，p-NF-κB p65 为磷酸化核因子κB p65。①与空白组比较，P<0.05。②与模型组比较，P<0.05。③与电针对照组比较，P<0.05。

?

表7 各组大鼠脊髓组织中炎症相关因子的表达/（ng/L，）

表7 各组大鼠脊髓组织中炎症相关因子的表达/（ng/L，）

注：TNF-α为肿瘤坏死因子α，IL-1β为白细胞介素1β，IL-6为白细胞介素6，IFN-γ 为γ干扰素。①与空白组比较，P<0.05。②与模型组比较，P<0.05。③与电针对照组比较，P<0.05。

?

3 讨论

中医学将SCI后NB 尿潴留归于“癃闭”范畴，肾气不足、正气亏损、膀胱气化失司、三焦不能同调水道是其主要病机，膀胱内充满尿液无法排出。大量研究表明，临床运用电针治疗可双向调节膀胱功能及抗泌尿系统感染［10-11］。笔者前期研究证实电针取穴“次髎”“中极”“三阴交”治疗SCI后NB 大鼠，可一定程度改善受损膀胱组织功能障碍。“次髎”属膀胱经，主治排尿不利而导致的尿潴留，骶神经（支配膀胱等盆腔脏器）位于该穴下，刺激“次髎”可激活传入神经元将刺激传导至脊髓排尿中枢，运动逼尿肌和括约肌节，引发排尿反射。“中极”为膀胱之募穴，是治六腑病的要穴，髂腹下神经（支配膀胱和直肠）位于该穴下，刺激“中极”可收缩膀胱逼尿肌，引发排尿反射，利于膀胱功能调节及气化。“三阴交”是足三经交会穴，主下焦气机不通，刺激“三阴交”可通过反射弧传导至脊髓后跟，刺激腰骶部排尿中枢，引发排尿反射，调节膀胱活动和功能。本研究构建SCI后NB 尿潴留大鼠模型后，大鼠膀胱最大容量、漏尿点压力和膀胱顺应性升高，说明模型大鼠尿潴留现象明显，膀胱功能障碍，造模成功。利用电针刺激SCI 后NB 尿潴留大鼠次髎、中极、三阴交后发现，膀胱最大容量、漏尿点压力和膀胱顺应性降低，与既往研究结果一致［12-13］，表明电针可改善SCI 后排尿中枢功能，刺激逼尿肌及括约肌活动，降低膀胱内压、最大容量，减少残尿量，恢复尿潴留大鼠膀胱功能。

SCI 后神经元和轴突中大量分泌炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 等），过度的神经元炎症加重了脊髓神经组织损伤，影响膀胱功能恢复，而电针可抑制SCI 大鼠的炎症反应，促神经系统恢复［14］。研究发现，SCI 后NF-κB 通路在脊髓组织神经组织中异常激活，大量研究表明抑制该通路可减轻神经元炎症反应，恢复调控功能［15-16］。正常状态下，NF-κB 在胞质中以IKB-NF-κB p65-NF-κB p50复合物形式存在，受到外界刺激因素（如TNF-α）后，IKBα发生磷酸化，而后被泛素化并降解，NF-κB p65移位入核，诱发一系列炎性因子表达。NF-κB 受到TNFR1/RIPK1 通路的调控，TNFR1 活化后会快速募集RIPK1，激活其下游IKKβ，IKKβ 活化进一步磷酸化IKBα，释放并激活NF-κB。研究［17］表明，通过抑制SCI 大鼠TNFR1 表达可减少组织损伤及炎症反应，改善运动功能。但电针能否通过调控TNFR1/RIPK1/NF-κB通路发挥作用尚未可知。

本研究结果显示，SCI 后NB 尿潴留大鼠脊髓组织TNFR1、RIPK1和p-IKKβ/IKKβ 蛋白表达升高，表明TNFR1/RIPK1 通路在SCI 后NB 尿潴留大鼠脊髓组织中显著激活；利用电针治疗后，TNFR1、RIPK1、p-IKKβ/IKKβ 蛋白表达降低，表明电针可抑制TN⁃FR1/RIPK1 通路活化。同时我们发现，在应用电针治疗后，大鼠脊髓组织p-NF-κB p65/NF-κB p65 及pIKBα/IKBα 蛋白表达降低，提示电针可通过抑制TNFR1/RIPK1通路活化进一步拮抗NF-κB。本研究还进行了NF-κB 下游炎症相关因子的检测，发现电针治疗可降低大鼠脊髓组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ 的水平，表明电针治疗后，TNFR1/RIPK1/NF-κB 通路被抑制，进而影响下游TNF-α、IL-1β、IL-6 和IFN-γ 的表达，减轻神经元炎症反应，促进神经组织修复，恢复排尿中枢功能，改善膀胱功能。

既往研究证实，电针刺激“中极”“次髎”“三阴交”可显著改善SCI 后NB 尿潴留，但相关机体机制研究较少，主要为抑制神经元凋亡（如活化PI3K/AKT 通路和拮抗NGF/TrkA 通路），与笔者前期研究发现电针可抑制PTEN/Akt 通路抑制神经元凋亡相似。而对于SCI后脊髓组织中广泛的炎症反应和异常激活的NF-κB，电针对其的调控机制尚未见研究。既往研究中，不乏围绕NF-κB 对电针调控机制的研究，如电针抑制NF-κB 活性改善大鼠认知障碍［18］、治疗高血压性脑出血［19］和溃疡性结肠炎［20］等。本研究首次发现电针可通过抑制TNFR1/RIPK1 通路拮抗NF-κB 活化，减轻脊髓神经元炎症反应，重塑部分脊髓神经功能，使逼尿肌和括约肌正常活动，改善SCI后NB尿潴留大鼠膀胱功能。

综上所述，本研究结果表明电针“次髎”“中极”“三阴交”可改善SCI 后NB 尿潴留大鼠膀胱功能，其机制可能与抑制TNFR1/RIPK1/NF-κB 通路，减轻神经元炎症反应，促进神经组织修复有关，表明电针在治疗SCI 后NB 尿潴留有较好疗效，具有明显抗炎效应，临床应用价值较高，值得应用、推广。