柚皮苷对复发性口腔溃疡大鼠TNF-α、IL-6和EGF水平的影响

高晓燕,廖莹莹

湖北医药学院附属人民医院口腔医学中心,湖北十堰 442000

复发性口腔溃疡(ROU)常发于口腔黏膜中,患病率可高达20%,女性高于男性,给患者带来极大的困扰[1-2]。目前ROU治疗方法主要以局部治疗和全身治疗为主,但治疗效果均不佳,患者依从性较差[3]。近年来,中医药以成本低、不良反应小在临床治疗上被广泛使用,尤其是在ROU的治疗上发挥较大的作用[4]。研究证明柚皮苷具有多种生物活性,但是在口腔溃疡疾病的治疗中研究较少[5]。研究表明炎症介质和生长因子在很大程度上影响口腔溃疡的发生发展,如甘美达可能通过抑制溃疡组织中炎症介质的释放,升高生长因子的表达,改善口腔溃疡[6]。本研究旨在探索柚皮苷对ROU大鼠溃疡组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、表皮生长因子(EGF)、白细胞介素(IL)-6水平的影响。

1 材料与方法

1.1材料 于苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司购买6周龄、清洁级、雌雄各半的SD大鼠72只(体重180～210 g),许可证号:SCXK(苏)2019-0007。饲养条件:温度22～25 ℃,湿度40%～60%,自由饮水进食。

1.2仪器与试剂 于北京六一仪器厂购买转膜仪,于美国Bio-Rad公司购买MODEL-550型酶标仪。于四川省维克奇生物科技有限公司购买柚皮苷(CAS号:10236-47-2),于Merck公司购买完全弗氏佐剂(货号:F5881),于华中药业股份有限公司购买醋酸泼尼松龙注射液(国药准字:H42021216),于北京雷根生物技术有限公司购买苏木精-伊红(HE)染色液(货号:DH0006),于上海通蔚实业有限公司购买IL-6 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(货号:TW3160)、EGF ELISA试剂盒(货号:TW24682),于上海纪宁实业生物科技有限公司购买TNF-α ELISA试剂盒(货号:JN110),于Abcam公司购买TNF-α(货号:ab215188)、EGF(货号:ab184265)、IL-6(货号:ab233706)一抗。

1.3方法

1.3.1ROU大鼠的制备、分组及给药 参照高峻鹰等[7]操作方法制备ROU大鼠模型:随机选取12只大鼠,在大鼠口腔黏膜处注射生理盐水,该操作于无菌条件下进行,剥离口腔黏膜置于研磨器中,分别向其中加入PBS缓冲液(0.1 mL,pH值为7.4)、完全弗氏佐剂,混合均匀直至乳状液无分层即可得到组织乳化剂备用。随机选取50只大鼠建立ROU大鼠模型,将大鼠脱毛去皮,于脊柱两侧经皮内注射组织乳化剂,将剩余10只正常大鼠作为对照组,给予对照组大鼠注射等体积的生理盐水,每次0.1 mL,1次/周,连续8周。当大鼠的颊黏膜、口底、唇黏膜等部位出现多个椭圆或圆形溃疡面,且溃疡表面的假膜直径约1～2 mm、颜色呈现灰黄色时,即表明ROU大鼠模型制备成功[7]。50只大鼠均符合上述建模成功的条件。将大鼠随机分为模型组、柚皮苷低剂量(25 mg/kg)组、柚皮苷中剂量(50 mg/kg)组、柚皮苷高剂量(100 mg/kg)组[8]、阳性对照组,10只/组。柚皮苷剂量组给予腹腔注射相应剂量的柚皮苷干预,阳性对照组给予20 mL/kg醋酸泼尼松龙注射液灌胃干预[7],对照组、模型组给予等体积的生理盐水,1次/天,连续干预20 d。

1.3.2观察大鼠溃疡情况 干预结束后,观察大鼠溃疡持续时间、数量及间隔时间,游标卡尺测定各组大鼠第0、10、20天溃疡面积的变化。

1.3.3收集标本 溃疡面积测定完成后,麻醉并处死大鼠,经腹部主动脉取血,静置、离心,取上清液,置于-40 ℃冰箱储存,用于ELISA试剂盒检测;切取各组大鼠溃疡组织,一部分置于甲醛溶液中固定,用于HE染色检验其病理学变化;另一部分置于-80 ℃冰箱中保存,用于后续蛋白质印迹法(Western blot)及免疫组化法检测TNF-α、IL-6和EGF水平。

1.3.4HE染色检测溃疡组织病理学变化 取上述1.3.3中溃疡组织,经脱水、包埋、制作切片,行HE染色、脱水、封片,于显微镜下观察病理学变化。

1.3.5ELISA检测血清中TNF-α、EGF和IL-6水平 取上述1.3.3中各组大鼠血清标本,严格按照ELISA试剂盒说明书检测血清中TNF-α、EGF和IL-6水平。

1.3.6免疫组化法检测大鼠溃疡组织中TNF-α、EGF和IL-6表达 取上述1.3.3中的溃疡组织,制备切片,切片常规脱蜡,加入3%H2O2孵育10 min,加入稀释后的TNF-α、EGF和IL-6一抗,4 ℃孵育过夜,室温孵育30 min,TBST洗涤,加入二抗37 ℃孵育1 h,PBS清洗,室温下采用3,3′-二氨基联苯胺显色,苏木素复染,二甲苯透明,中性树脂封片,拍照,观察溃疡组织中TNF-α、EGF和IL-6阳性表达。

1.3.7Western blot检测各组大鼠溃疡组织中TNF-α、EGF和IL-6蛋白水平 取上述1.3.3中的溃疡组织,匀浆,离心提取并测定总蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化、转膜、5%TBST脱脂奶粉封闭;封闭后洗膜,加入稀释后TNF-α、EGF和IL-6一抗,4 ℃恒温箱过夜;TBST洗涤,将膜放入到稀释后的二抗室温孵育1 h,ECL显色,拍照,以β-actin为内参,分析TNF-α、EGF和IL-6蛋白水平。

2 结 果

2.1柚皮苷对ROU大鼠溃疡情况的影响 与模型组比较,柚皮苷低、中、高剂量组大鼠口腔溃疡持续时间、数量均逐渐减少(P<0.05),间隔时间逐渐增加(P<0.05);与阳性对照组比较,柚皮苷高剂量组各项指标差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠口腔溃疡情况比较

2.2柚皮苷对ROU大鼠溃疡面积的影响 与模型组比较,柚皮苷低、中、高剂量组,在干预后第0天大鼠口腔溃疡面积差异无统计学意义(P>0.05);在干预后第10、20天大鼠口腔溃疡面积逐渐减少(P<0.05),且以柚皮苷高剂量组变化最为明显,但与阳性对照组差异无统计学意义(P>0.05)。与干预后第0天比较,干预后第10、20天各组大鼠口腔溃疡面积均减少(P<0.05)。与干预后第10天比较,干预后第20天各组大鼠口腔溃疡面积也减少(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠口腔溃疡面积比较

2.3柚皮苷对ROU大鼠溃疡组织病理学变化的影响 对照组大鼠无口腔溃疡发生;与对照组比较,模型组大鼠出现大量炎症细胞浸润,溃疡面积较大;与模型组比较,柚皮苷低、中、高剂量组大鼠炎症浸润逐渐减少,溃疡面积逐渐愈合,有纤维细胞、结缔组织形成;与阳性对照组比较,柚皮苷高剂量组无明显差异。见图1。

注:A～F分别为对照组、模型组、柚皮苷低、中、高剂量组、阳性对照组ROU大鼠溃疡组织病理学变化。

2.4柚皮苷对ROU大鼠血清中TNF-α、EGF和IL-6水平的影响 与对照组比较,模型组大鼠TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05),EGF水平降低(P<0.05);与模型组比较,柚皮苷低、中、高剂量组大鼠TNF-α、IL-6水平逐渐降低(P<0.05),EGF水平逐渐升高(P<0.05);与阳性对照组比较,柚皮苷高剂量组TNF-α、EGF和IL-6水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清中的TNF-α、EGF和IL-6水平比较

2.5柚皮苷对ROU大鼠溃疡组织中TNF-α、EGF和IL-6阳性表达的影响 免疫组化法检测TNF-α、EGF和IL-6阳性表达均为棕褐色或棕黄色颗粒。与对照组比较,模型组TNF-α、IL-6阳性表达增强,棕褐色或棕黄色颗粒明显增多,EGF阳性表达减弱,棕褐色或棕黄色颗粒较少;与模型组比较,柚皮苷低、中、高剂量组TNF-α、IL-6阳性表达减弱,棕褐色或棕黄色颗粒明显减少,EGF阳性表达增强,棕褐色或棕黄色颗粒逐渐增多;与阳性对照组比较,柚皮苷高剂量组TNF-α、EGF和IL-6阳性表达无明显差异。见图2～4。

注:A～F分别为对照组、模型组、柚皮苷低、中、高剂量组、阳性对照组大鼠溃疡组织TNF-α免疫组化染色图。

注:A～F分别为对照组、模型组、柚皮苷低、中、高剂量组、阳性对照组大鼠溃疡组织EGF免疫组化染色图。

注:A～F分别为对照组、模型组,柚皮苷低、中、高剂量组,阳性对照组大鼠溃疡组织IL-6免疫组化染色图。

2.6柚皮苷对ROU大鼠溃疡组织中TNF-α、EGF和IL-6蛋白水平的影响 与对照组比较,模型组大鼠TNF-α、IL-6蛋白水平升高(P<0.05),EGF蛋白水平降低(P<0.05);与模型组比较,柚皮苷低、中、高剂量组大鼠TNF-α、IL-6蛋白水平逐渐降低(P<0.05),EGF蛋白水平逐渐升高(P<0.05);与阳性对照组比较,柚皮苷高剂量组TNF-α、EGF和IL-6蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图5、表4。

注:A为对照组;B为模型组;C为柚皮苷低剂量组;D为柚皮苷中剂量组;E为柚皮苷高剂量组;F为阳性对照组。

表4 各组大鼠溃疡组织中的TNF-α、EGF和IL-6蛋白水平比较

3 讨 论

ROU是一种反复发作的疾病,在中医学上属于“口疮”“口糜”等范围。免疫功能低下的患者,一旦患有口腔溃疡,口腔黏膜经常会伴随浅表性溃疡的反复发作,影响患者的饮食甚至表达能力[9-10]。ROU的发病机制复杂,与微量元素及维生素缺乏、细菌和病毒感染、精神、饮食等多方面的因素有关,目前国内外尚无根治ROU的特效疗法,以对症治疗为主,促进口腔溃疡面积的愈合,延长发作间歇期[11-12]。本研究建立了ROU大鼠模型,当大鼠在颊黏膜、口底、唇黏膜等部位出现多个椭圆或圆形溃疡面,且溃疡表面的假膜直径约1～2 mm、颜色呈现灰黄色时,即表明ROU大鼠模型制备成功,可进入下一步的研究。

在治疗ROU时,传统的中草药具有缩短病程、改善口腔溃疡症状、减少复发等优势[13]。药理研究表明,柚皮苷具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤及抗病毒等作用[14]。AKAMO等[15]研究表明,柚皮苷可以减轻纤维化及炎症反应,改善肝细胞功能障碍,起到护肝作用。YANG等[16]研究发现,柚皮苷可以抑制成纤维细胞中TNF-α、IL-6的产生,为治疗炎症反应导致的无菌性松动、骨溶解提供潜在价值。但柚皮苷对口腔溃疡产生的炎症因子是否影响尚未有报道。但ROU一旦发生,炎症因子水平往往会升高,长时间的炎症反应会影响机体细胞生长、创面血管新生、创面愈合,甚至使机体免疫功能发生障碍,出现“难愈性创面”,故炎症因子水平的降低对治疗ROU具有关键作用[17]。本研究结果发现,模型组大鼠出现大量炎症细胞浸润,血清中及溃疡组织中TNF-α、IL-6水平升高,经柚皮苷干预后,柚皮苷低、中、高剂量组大鼠溃疡组织病理学状况得到改善,溃疡持续时间、数量减少,血清中及溃疡组织中TNF-α、IL-6水平降低,间隔时间增加,溃疡面积随着时间及柚皮苷剂量的增加均得到改善。提示柚皮苷可以有效抑制炎症因子水平,改善口腔溃疡组织的病理状况,为进一步的溃疡愈合提供可能。

EGF主要存在于口腔黏膜的基底细胞层和棘细胞层,是机体内的一种活性物质,对口腔黏膜起着重要的保护作用,刺激表皮生长因子受体酪氨酸激酶磷酸化,进而修复受损组织,修补增生肌肤表层细胞,最大程度地促进口腔黏膜上皮细胞的生长、分化和增殖[18-19]。本研究发现,模型组血清中及溃疡组织中EGF水平降低;经柚皮苷干预后,柚皮苷低、中、高剂量组血清中及溃疡组织中EGF水平升高。说明柚皮苷可以加速血管新生,促进细胞生长增殖及溃疡组织愈合,从而对ROU起到治疗作用。

综上所述,柚皮苷可以明显缓解ROU病理程度,降低ROU大鼠血清及溃疡组织中IL-6、TNF-α水平,升高EGF水平,促进ROU大鼠溃疡愈合,但具体机制较为复杂,且远期治疗效果有待进一步研究。