复合菌群构建及其对马铃薯渣动物饲料的发酵条件优化

连 洁 王 薇 梁瑞雪 侯 艳 戚月娜 刘晓飞

（哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150028）

马铃薯渣是马铃薯淀粉生产中主要的副产品，包括土豆皮和残渣，其化学成分包括淀粉、纤维素、半纤维素和果胶等[1-2]。这些副产品因其高水分含量，不易储存和运输，通常被丢弃，导致严重的环境负担和经济损失，应进行适当的处理和合理的再利用，提高其废物价值[3-4]。马铃薯渣含有丰富的粗纤维和蛋白质，可作为饲料添加剂使用，而马铃薯渣中粗纤维的营养功能和作用与能量饲料相同。因此，马铃薯渣具备饲料化的基础条件，是一种具有开发前景的饲料原料。

生物发酵是一种降解薯渣的可行方法，具有降解效率高、发酵设备简单、投资低等优点[5-7]。微生物发酵制备的饲料的香味独特、口感好、蛋白含量高[8]，可通过利用或酶解纤维素提高动物吸收利用的效率。单个微生物酶活性较低，建立共同培养体系可增加微生物间相互作用，弥补选择性菌株产酶特性的不足[9]。研究表明，菌株协同下发酵的马铃薯渣饲料具有更好的效果，将添加发酵马铃薯渣的饲料饲喂反刍动物可提高奶牛的乳品质和生产性能，改善瘤胃内环境等[10-11]；饲喂禽类动物可提高蛋白质的利用率、产蛋率和改善肉质等[12-14]；饲喂猪、兔可以提高平均日增重、生产性能，改善营养物质的消化率等[15-17]。因此，发酵后的马铃薯渣可作为饲料在动物生产中应用[18-19]，从而充分利用薯渣资源，具有良好的经济效益。本试验选取实验室保藏的2 株纤维素酶活较高的菌株AAG-17 和CPA-3-4，构建复合菌群提高马铃薯渣的降解和利用，为马铃薯渣动物饲料的深入应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源

马铃薯购自黑龙江省哈尔滨市的大润发超市，通过捣碎获取固状物，反复清洗，烘干，粉碎，过40 目筛，得到马铃薯渣样品。

菌株：实验室保藏的菌株AAG-17 和CPA-3-4（同为链霉菌属）。

1.1.2 仪器与设备

LDZX-75KBS 立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、DHC-9123A 鼓风干燥机（上海一恒科学仪器有限公司）、ZHJH-C1115B 超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）、THZ-98AB恒温摇床培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司）、DHG-9123A 电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、UV-5200 紫外-可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）、S-3400N扫描电镜（日立高新技术公司）。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 培养基制备

燕麦汁琼脂（ISP3）固体培养基[20]：燕麦片2.00%，KNO30.02%，K2HPO4·3H2O 0.05%，MgSO40.02%，琼脂粉2.00%，pH值7.20～7.40。

发酵培养基[20]：马铃薯渣2.00 g，(NH4)2SO40.40%，KH2PO40.20%，MgSO40.05%，蛋白胨1.00%，牛肉膏0.50%，pH值7.20～7.40。

1.2.2 拮抗性试验

将2株菌（AAG-17、CPA-3-4）不相交地划在ISP3培养基上，28 ℃倒置培养7～15 d，观察现象。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 发酵时间对马铃薯渣降解率的影响

培养基初始pH 值为7，发酵转速为180 r/min，接菌量为1%，接菌比例为1∶1，28 ℃恒温条件下培养，探究不同发酵时间（1、3、5、7、9 d）对马铃薯渣降解率的影响。

1.2.3.2 培养基初始pH值对马铃薯渣降解率的影响

发酵转速为180 r/min，接菌量为1%，接菌比例为1∶1，培养5 d，28 ℃恒温条件下培养，考察不同培养基初始pH值（4、5、6、7、8）对马铃薯渣降解率的影响。

1.2.3.3 发酵转速对马铃薯渣降解率的影响

培养基初始pH 值为7，接菌量为1%，接菌比例为1∶1，培养天数5 d，28 ℃恒温条件下培养，探究不同发酵转速（140、160、180、200、220 r/min）对马铃薯渣降解率的影响。

1.2.3.4 发酵温度对马铃薯渣降解率的影响

培养基初始pH 值为7，发酵转速为180 r/min，接菌量为1%，接菌比例为1∶1，培养5 d，探究不同发酵温度（24、26、28、30、32 ℃） 对马铃薯渣降解率的影响。

1.2.3.5 接菌量对马铃薯渣降解率的影响

培养基初始pH 值为7、发酵转速为180 r/min、接菌比例为1∶1、培养天数5 d、28 ℃恒温条件下培养，探究不同接菌量（1%、2%、3%、4%、5%）对马铃薯渣降解率的影响。

1.2.3.6 接菌比例对马铃薯渣降解率的影响

培养基初始pH 值为7，发酵转速为180 r/min，接菌量1%，培养5 d，28 ℃恒温条件下培养，探究CPA-3-4和AAG-17 不同接菌比例（1∶5、1∶3、1∶1、3∶1、5∶1）对马铃薯渣降解率的影响。

1.2.4 响应面法优化试验

根据单因素的试验结果，选取培养基初始pH 值（A）、发酵转速（B）、接菌量（C）和接菌比例（D）为考察因素，响应面试验因素水平设计见表1。

表1 响应面试验因素水平设计

利用Design-Expert 8.0 软件进行条件优化，确定复合菌群降解马铃薯渣的最优发酵条件。

1.2.5 马铃薯渣降解率

将构建好的复合菌群接种至发酵培养基中，发酵后进行过滤处理，冲洗2～3 次（蒸馏水），105 ℃烘干至恒重，计算马铃薯渣降解率（Y）。

式中：W0为降解前马铃薯渣质量（g）；W1为降解后马铃薯渣质量（g）。

1.2.6 扫描电镜

在响应曲面法确定的最优条件下降解马铃薯渣，将降解前后的马铃薯渣样品先用2.5%戊二醛固定再用锇酸固定，磷酸缓冲液冲洗，使用低浓度到高浓度的乙醇逐级梯度脱水，临界点干燥、黏合、喷金，进行扫描电镜，观察组织结构变化[21]。

1.2.7 红外光谱

在响应曲面法确定的最优条件下降解马铃薯渣，将降解前后马铃薯渣样品粉末与KBr以1∶100的比例混合，放入玛瑙研钵中研磨，压片，之后进行红外光谱观察[22]。

2 结果与分析

2.1 菌株间拮抗性试验结果（见图1）

图1 菌株间的拮抗性

由图1可知，2株菌株之间未产生明显的抑菌圈，均能互不干扰地生长在一起，即2 株菌株间不存在拮抗现象，可应用于复合菌群的构建。

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 不同发酵时间对马铃薯渣降解率的影响（见图2）由图2可知，在发酵前期（1～5 d），马铃薯渣降解率随发酵天数呈上升趋势，可能是由于培养基中的营养成分逐渐变充足，随着时间增加，菌体不断通过降解马铃薯渣利用这一碳源，进而促进菌体生长繁殖，快速分泌出纤维素酶。在发酵后期（5～9 d），马铃薯渣的降解率几乎没有变化，可能是由于培养基中的营养物质耗竭或菌体衰亡，导致复合菌群的生长繁殖和纤维素酶的产生受到抑制，酶活性逐渐趋于平稳。综合考虑时间、经济等因素，复合菌群最适发酵时间为5 d。

图2 不同发酵时间对马铃薯渣降解率的影响

2.2.2 不同培养基初始pH 值对马铃薯渣降解率的影响（见图3）

图3 不同培养基初始pH值对马铃薯渣降解率的影响

由图3 可知，随着培养基初始pH 值增加，马铃薯渣的降解率呈先上升后下降趋势。当培养基初始pH 值从4增加至7 时，马铃薯渣的降解率不断上升且达到最大值32.68%，表明复合菌群在中性pH值环境下具有较好的降解率。极端的pH 值会抑制菌株的生长和胞外酶的变性，中性pH值满足其生长特性，此时分泌的酶最多，效果最好。因此，选择培养基初始pH值7作为最适条件。

2.2.3 不同发酵转速对马铃薯渣降解率的影响（见图4）

图4 不同发酵转速对马铃薯渣降解率的影响

由图4 可知，马铃薯渣降解率随着发酵转速的增加呈先上升后下降的趋势。当发酵转速为120 r/min 时，由于转速较低没有提供给菌体足够的氧气水平，无法满足菌体的生长需求，此时产酶能力较低。随着发酵转速升高，逐渐达到菌体生长需求，产酶能力也逐渐增强，当转速为160 r/min 时，马铃薯渣的降解率最高为33.17%，此时为复合菌群最适宜的发酵转速，有助于相关酶的产生。当转速大于160 r/min 时，马铃薯渣的降解率开始降低，可能是由于放线菌菌株产生的菌丝发生了断裂，影响了纤维素酶的活性。

2.2.4 不同发酵温度对马铃薯渣降解率的影响（见图5）

图5 不同发酵温度对马铃薯渣降解率的影响

由图5可知，发酵温度从24 ℃上升到28 ℃时，降解率逐渐上升，当温度为28 ℃时，降解率达到最大为31.98%，之后随着温度升高，降解率开始下降。开始温度较低，微生物的生长较慢，随着温度逐渐上升，菌体达到最佳生长温度（28 ℃），开始分泌大量的酶，马铃薯渣的降解率达到最高。因此，选择28 ℃作为发酵的最佳温度。当温度过高时，微生物会生长较快，菌体逐渐发生老化，酶的产量也开始下降，说明高温或低温均会使马铃薯渣的降解受到影响。

2.2.5 不同接菌量对马铃薯渣降解率的影响（见图6）

由图6 可知，接菌量从1%增加至5%，马铃薯渣降解率呈先上升后下降的趋势。当接菌量为1%时，复合菌群生长缓慢，分泌的纤维素酶也相对较少。马铃薯渣降解率达最高时，接菌量为2%，此时为最适接菌量。随着接菌量不断增加，马铃薯渣的降解开始受到抑制，可能是因为接菌量过多会加快培养基中营养物质的耗尽，进而阻碍酶的产生。

2.2.6 不同接菌比例对马铃薯渣降解率的影响（见图7）

图7 不同接菌比例（CPA-3-4∶AAG-17）对马铃薯渣降解率的影响

由图7 可知，马铃薯渣的降解率呈先上升后下降的趋势。当接菌比例（CPA-3-4∶AAG-17）为3∶1 时，降解率最大，且与其他比例的接菌量呈现显著性差异。此时菌体生长速度最快，分泌的纤维素酶也最多。

2.3 响应面法条件优化结果分析（见表2、表3）

表2 响应曲面试验设计方案及结果

根据单因素试验的结果进行处理和分析后，找到各因素共同作用下的最优降解条件，即选择培养基初始pH 值7、发酵转速160 r/min、接菌量2%、接菌比例（CPA-3-4∶AAG-17）3∶1 为马铃薯渣最佳发酵条件，各因素的最佳条件点左右各选取一个试验点进行响应面优化试验。

利用Design-Expert 8.0软件对表2中的试验数据进行响应面回归分析，得到该试验回归模型方程。对试验数据进行多元回归拟合，得到二阶多项式回归模型为：

Y=36.68+0.48A+1.36B+0.41C+0.72D-0.28AB-0.39AC+0.13AD-0.06BC+0.45BD+1.08CD-3.55A2-3.45B2-2.11C2-5.05D2。

由表3可知，马铃薯渣降解率回归方程的P＜0.000 1，表明马铃薯渣降解率的回归方程与全部自变量间的关系极显著；而马铃薯渣降解率回归方程的失拟项P值大于0.05，差异性不显著，表明该回归模型与实测值能够较好地拟合。

其中，BD、AC和CD的P＜0.05对马铃薯渣降解有显著影响，其关联度排列为BD＞AC＞CD。

为了阐明各因素之间交互项的作用机理，找出各个交互项对马铃薯渣降解率的影响趋势。利用Design-Expert 8.0软件对表中数据进行多元回归拟合，得到二次多元回归拟合模型。

各交互作用对马铃薯渣降解率的影响见图8～图10。

由图8～图10 可知，培养基初始pH 值和接菌量、发酵转数和接菌比例以及接菌量和接菌比例的交互作用对实验结果影响显著，与方差分析结果一致。

2.4 验证试验

综合单因素和Design-Expert 8.0 软件上多元回归分析的结果，设置马铃薯渣降解率达到最大值，选择出最优的降解条件为培养基初始pH值7、发酵转速160 r/min、接菌量2%、接菌比例（CPA-3-4∶AAG-17）3∶1，在此工艺参数下马铃薯渣降解率理论值为36.58%。为进一步验证，在此发酵条件下进行重复试验，得到马铃薯渣降解率为36.90%。此数值与响应面试验的理论值相差不大，证明该响应面模型可靠，优化效果良好。因此，将Plackett-Burman 法与响应面法相结合，可以节约试验资源，获得最优条件。

2.5 复合菌群降解前后马铃薯渣扫描电镜结果（见图11）

图11 复合菌群降解前后马铃薯渣扫描电镜结果

由图11（a）可知，未经复合菌群降解的马铃薯渣结构表面紧密、光滑，整体结构比较完整。由图11（b）可知，经复合菌群降解的马铃薯渣结构发生了明显变形，变得粗糙、多孔和可渗透，具有更易接近的表面积。表明复合菌群的介导在马铃薯渣基质中造成了孔洞和裂缝，证明复合菌群具有较好的马铃薯渣降解能力。

2.6 复合菌群降解前后马铃薯渣红外检测结果（见图12）

图12 复合菌群降解前后马铃薯渣红外检测结果

由图12可知，红外光谱显示了降解前后马铃薯渣的变化。与空白组（未接种复合菌群）相比，降解后马铃薯渣的吸收峰均有所降低。在3 282 cm-1处为马铃薯渣中不饱和C—H的伸缩振动峰，在1 636 cm-1处为C=C键的伸缩振动峰。加入复合菌群降解后，1 636 cm-1处试验组（接种复合菌群）的C=C键伸缩振动峰相对增强，这可能是马铃薯渣中C—C 键由于菌系产生的酶水解断裂形成C=C 键所致，表明复合菌群可以降解马铃薯渣中纤维素的C—C键，从而有效降解马铃薯渣。

3 结论

本试验构建出一组复合菌群，通过Plackett-Burman选择单因素中显著性较高的因子，运用Design-Expert 8.0软件，以马铃薯渣降解率为考察指标，得到最优发酵条件，衡量复合菌系酶解纤维素的能力。结果表明，在此优化条件下重复试验，马铃薯渣降解率可达36.90%；扫描电镜可知，降解后的马铃薯渣具有多孔结构和更多的结合位点；红外光谱分析表明，降解后的马铃薯渣中纤维素发生了水解。

微生物菌系可将纤维素等大分子碳水化合物降解为低分子的单糖或多糖，从而提高动物对纤维素类物质的消化和吸收。因此，将发酵后的马铃薯渣添加到动物饲料中可以提高饲料适口性、改善饲料品质、提高动物的生产性能以及消化率等。后续试验将以复合菌群发酵的马铃薯渣为原料，探究其添加在动物饲料中的配方、比例以及对动物生产性能的影响，为进一步实现马铃薯渣的饲料化利用提供参考。