沉默lncRNA MALAT1表达对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

王壮壮 刘彦廷 龚 伟 周 猛 贾文学 艾文兵 田春雷

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，5 年生存率低于6%，中位生存期仅14.6 个月[1]。由于具有复杂的生物学特性，胶质瘤通常需要采取最大可能保留神经功能为主的切除术辅以术后放化疗等综合治疗方案[2]。目前，胶质瘤在免疫治疗、肿瘤电场治疗和分子靶向治疗上研究进展迅速，但这些治疗方案并没有为胶质瘤病人带来更大的生存获益，胶质瘤病人的总体预后仍然相对较差[3]。因此如何突破当前胶质瘤特别是胶质母细胞瘤治疗的困境是研究者亟待解决的关键。近年来的研究发现，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）参与调控多种恶性肿瘤生物学行为[4]。lncRNA转移性肺腺癌相关基因转录本1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript1，MALAT1）位于细胞核散斑，是一种重要的亚细胞核结构[5]，与核散斑相关蛋白相互作用，通过激活肿瘤细胞内异常信号通路或竞争性抑制微小RNA（miRNA）的表达等多种机制来调控肿瘤细胞的恶性生物学行为[6，7]。本文探讨沉默lncRNA MALAT1 表达对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 生信分析从中国脑胶质瘤基因组计划数据库（Chinese glioma atlas，CGGA；http://www.cgga.org.cn/）下载lncRNA MALAT1的临床数据，使用R软件分析低级别胶质瘤（low grade glioma，LGG）和高级别胶质瘤（high grade glioma，HGG）中lncRNA MALAT1的表达变化；生存曲线比较低表达和高表达lncRNA MALAT1胶质瘤的总体生存率（overall survival，OS）。

1.2 细胞实验

1.2.1细胞的来源 人星形胶质细胞（NHA）和胶质瘤细胞系（U87、U251、A172、T98G）购于华中科技大学同济医院神经病学研究所，保存于液氮罐和-80 ℃冰箱中。

1.2.2 RT-PCR 检测胶质瘤细胞lncRNA MALAT1 的表达 使用Trizol 试剂提取总RNA，用Primescript 逆转录试剂盒合成cDNA。ABI Prism7500型荧光定量PCR仪进行扩增，每孔加入20 μl反应体系（2 μl cDNA，10 μl 蛋白酶，0.5 μl 上下游产物，7 μl 灭菌双蒸水），重复进行3 次实验，每组设置3 个复孔。以GAPDH 为 内 参（上 游 引 物 序 列 5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3'，下游引物序列5'-ACACATTGGGGGTAGGAACA- 3'），lncRNA MALAT1 上 游 引 物 序 列 5'- GGACAGGTCAGAGGGTTTC-3'，下游引物序列5'-CTCGTAACTCTTCTCTGTGCC-3'。用2-△△Ct法计算lncRNA MALAT1的相对表达水平。

1.2.3 质粒的构建与细胞转染 将含lncRNA MALAT1质粒的大肠杆菌菌液接种于含氨苄霉素培养基中，37 ℃培养14～16 h 进行扩增。以3 000 转/min 离心10 min 后收集菌液。按照质粒提取试剂盒（广州锐博生物科技有限公司）步骤操作收集质粒，保存于-20 ℃。取对数生长期胶质瘤细胞，接种于6孔板，使用不含抗生素的DMEM 培养24 h。每孔依次加入200 μl Buffer 缓冲液、800 ng 质粒、4 μl 转染试剂混合液，静置10 min，均匀转染各孔24 h 后观察。sh-MALAT1 组转染lncRNA MALAT1 质粒，sh-NC转染空白质粒。

1.2.4 CCK-8 法检测细胞增殖 将U87 与A172 细胞接种于96孔板，密度为5×103个/孔，轻轻旋转使细胞均匀分散，37 ℃培养12 h、24 h、48 h、72 h，向每个孔加入CCK8 试剂约10 μl 孵育2 h。使用酶标仪检测450 nm波长吸光密度值并制作增殖曲线。每组选4个复孔。

1.2.5 免疫印迹法检测相关蛋白的表达 收集细胞，采用RIPA细胞裂解液充分裂解，并用BCA试剂盒测定蛋白浓度。取40 μg 蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压设置为120 V。电泳结束后，120 V转膜150 min，用5% BSA 封闭PDVF 膜，加入STMN1、RAB5A和ATG4D一抗4 ℃孵育过夜，次日再用PBST缓冲液洗涤3 次，每次5 min，再用GAPDH 标记的二抗孵育2 h，洗涤后滴加EC发光液显影，Image J软件分析条带灰度值。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 将对数生长期的胶质瘤细胞系U87、A172细胞离心后弃去上清液，依次加入碘化丙碇和异硫氰酸荧光素各6 μl 混匀，避光培养30 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.3 统计学分析使用R4.0、Graphpad8.0软件进行分析；计量资料用±s表示，使用t检验和方差分析；P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 生信分析结果lncRNAMALAT1 在LGG 和胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM）中表达量均高于正常组织（P＜0.05；图1A），且GBM 表达量明显高于LGG（P＜0.05；图1A）。lncRNA MALAT1 高表达GBM 病人OS明显缩短（P＜0.05；图1B）。

图1 检索CGGA数据库分析胶质瘤lncRNA MALAT1的表达情况

2.2 细胞实验结果

2.2.1 lncRNA MALAT1在胶质瘤细胞系中的表达情况 与正常脑星形胶质细胞（NHA）相比，U87、A172、U251、T98G 细胞lncRNA MALAT1 相对表达量显著升高（P＜0.01；图2），而且，U87 和A172 细胞增高最明显；因此，使用U87 和A172 细胞系进行后续细胞实验。

图2 胶质瘤细胞系lncRNA MALAT1的表达情况

2.2.2 沉默lncRNA MALAT1表达抑制胶质瘤细胞的增殖sh-MALAT1组U87和A172细胞增殖活性均明显低于sh-NC组（P＜0.05；图3），而且随时间延长，细胞增殖活性明显降低（P＜0.05；图3）

图3 沉默lncRNA MALAT1表达抑制胶质瘤细胞增殖

2.2.3 沉默lncRNA MALAT1表达促进胶质瘤细胞的凋亡sh-MALAT1组U87和A172细胞凋亡率明显高于sh-NC组（P＜0.01；图4）。

图4 沉默lncRNA MALAT1表达促进胶质瘤细胞凋亡

2.2.4 沉默lncRNA MALAT1 表达抑制STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋白的表达TargetScan 软件分析显 示STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋 白 为lncRNA MALAT1的下游靶点。CGGA数据库分析显示，胶质瘤 组 织lncRNA MALAT1 与STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋白的表达量呈正相关（r分别为0.608、0.833、0.737；P＜0.05）。免疫印迹法检测U87和A172细胞STMN1、RAB5A和ATG4D的表达结果显示，sh-MALAT1 组U87 和A172 细 胞STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋白表达量明显高于sh-NC 组（P＜0.05；图5）。

图5 沉默lncRNA sh-MALAT1抑制胶质瘤细胞STMN1、RAB5A和ATG4D的蛋白表达

3 讨论

lncRNA在肿瘤细胞分化、表观遗传和细胞分裂周期调控等多种生命活动中发挥重要作用[8]。lncRNA MALAT1主要在细胞的核散斑中表达，通过调节丝氨酸/精氨酸剪接因子的活性来调控mRNA的选择性剪接，促进肿瘤的恶性增殖进程[9]。另外，lncRNA MALAT1可通过诱导m6A 甲基化介导miR-1914-3p表达，促进非小细胞肺癌细胞生长[10]。在胃癌细胞中，lncRNA MALAT1 过表达激活PI3K/AKT信号通路，促进癌细胞异常增殖和迁移[11]。还有研究发现，lncRNA MALAT1 与NEAT1 共同作用于PTBP3，导致P53 失活，调控肝癌细胞的增殖与侵袭[12]。

本文结果发现，胶质瘤组织lncRNA MALAT1呈高表达，与病人的不良预后密切相关；细胞实验发现，沉默lncRNA MALAT1 表达，能够抑制U87 和A172 细胞增殖，促进凋亡；TargetScan 预测显示，lncRNA MALAT1 与STMN1、RAB5A、ATG4D 蛋白可能存在结合位点，免疫印迹法检测结果显示下调lncRNA MALAT1 抑制STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋白的表达。有研究报道，STMN1、RAB5A 和ATG4D与NF-κB 信号通路的异常激活存在相关性[13]。lncRNA MALAT1可能通过调控NF-κB信号通路，上调STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋白的表达，进而对胶质瘤细胞的增殖和凋亡等生物学行为产生影响。

总之，胶质瘤lncRNA MALAT1 呈高表达，可能通过靶向上调STMN1、RAB5A 和ATG4D 蛋白的表达水平，促进胶质瘤细胞增殖、抑制胶质瘤细胞凋亡。沉默lncRNA MALAT1 表达明显抑制胶质瘤细胞增殖、促进其凋亡。