基于网络药理学与分子对接探讨紫苏预防心血管疾病的作用机制

李旻玥，蒋朝芬，钟匀，苏正伟，李兴玉，

1.云南农业大学农学与生物技术学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学理学院，云南 昆明650201

紫苏是唇形科草本植物[1-2]，是一种传统药食同源植物，已列入《药食同源物品名录》[3-4]。2020 年版《中华人民共和国药典》中记载紫苏性温、味辛[5]。其药用价值和食用方法在《本草纲目》有记载[6-7]。我国现已研制出10 多种含有紫苏的中药制剂[2]，此外，紫苏还是一种保健品。

紫苏的化学成分主要有黄酮类、挥发油、脂肪酸类、香豆素类等[8-9]。紫苏在临床上可用于治疗寻常疣、鱼蟹中毒[10]，可解热、降血脂等[11]。长期食用还可预防和治疗心血管疾病（CVD）[12-14]。

CVD 是一种常见慢性疾病之一。高血压病、冠心病等都属于CVD，CVD 患者会出现头晕、心悸等症状。CVD 发病隐匿、并发症严重，严重影响人们的生活质量[15-16]。在我国，CVD 的患病率逐渐上升且年轻化，根据《中国心血管病报告2018》概要[17]，我国CVD 患病人数近3亿，若不采取措施，在今后10 年患病率和病亡率将会急剧增长。全球CVD 的形势也很严峻，严重危及患者家庭和社会[18]。

中药紫苏在治疗CVD 方面的安全性高，有显著疗效，虽然紫苏的多种成分已有研究，但紫苏的全方位研究文献较少，药理作用分析不够完善。因此，本研究运用网络药理学探究紫苏的活性成分及其治疗CVD 的作用机制。

1 材料与方法

1.1 紫苏活性成分及其作用靶标以“紫苏”为关键词在中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）（https：//tcmsp-e.com/）中检索得到紫苏的全部化学成分及靶点，以口服生物利用度（OB）≥20%，类药性（DL）≥0.10[19]为条件进一步筛选紫苏的有效化合物及其作用靶点。

1.2 CVD 靶点以“Cardiovascular”or“Cardiovascular Neurosis” or “Atherosclerosis” or “Myocardial Infarction”or“Cardiopathy”为关键词在人类基因数据库GeneCards（https：//www.genecards.org/）和人类孟德尔遗传数据库（OMIM）（https：//www.omim.org/）中检索，删除重复项得到CVD 的相关靶基因。

1.3 药物-疾病共同靶点将紫苏活性成分的作用靶点与CVD 靶点进行交集，导入Venny 2.1 在线软件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）中制作韦恩图，得到共同靶基因。

1.4 蛋白互作（PPI）网络的构建及拓扑分析在STRING 数据库（https：//string-db.org/）中对交集靶点进行检索，物种设置为“Homo sapiens”，其他条件默认，获得PPI 初步网络。然后获取靶点相互作用的网络关系数据，将其导入Cytoscape 软件（版本3.8.2）制作PPI 网络图。并利用Cytoscape 软件中cytoHubba 插件获得degree（度值）排名前10 的核心靶点[20]。

1.5 “成分-靶点-通路-疾病”网络构建在Cytoscape软件构建“成分-靶点-通路-疾病”关系网络，并对其进行网络可视化。其中节点表示紫苏活性成分、靶点、通路和疾病；边表示各节点之间的相互关系。

1.6 GO 功能富集分析通过STRING 数据库（https：//string-db.org/）获得GO 功能富集分析数据；再通过Cytoscape 软件中的“BiNGO”插件获得GO 功能富集相关数据的P-value 值。使用线上制图工具微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）绘制GO 功能富集分析气泡图。

1.7 KEGG 富集分析利用STRING 数据库获得和KEGG 通路富集分析的数据，根据富集的基因数目选取最多的前20 条信号通路，利用线上制图工具微生信平台绘制KEGG 气泡图。

1.8 分子对接验证选取成分-靶点-通路-疾病网络图中degree 值较高的4 个关键化合物和KEGG气泡图中最重要的前4 条信号通路对应的关键蛋白，通过PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得活性成分的2D 结构，用Chem 3D 进行能量最小化处理后作为配体，运用PDB 数据库（https：//www.rcsb.org/）下载关键靶点的3D 结构，将其导入Pymol 软件进行处理后作为受体。利用AutoDock 软件进行分子对接，并运用Pymol 软件将对接结果进行可视化分析。

2 结果与分析

2.1 紫苏有效成分及靶点筛选见表1。通过TCMSP 数据库查询312 种紫苏化学成分，根据OB≥20%，DL≥0.10 的条件筛选后有41 个活性成分。通过TCMSP 数据库中Related Targets 获得主要活性成分对应靶点2 481个，去除重复值后用Perl 软件以Symbol 形式标准化后得94 个靶点。

表1 紫苏活性成分

2.2 CVD 靶点筛选通过GeneCards 数据库检索得到15 227 个靶基因，通过OMIM 数据库检索得到36 个靶基因，数据整合并删除重复值后得到15 138 个CVD 相关靶蛋白基因。

2.3 药物-疾病共同靶点见图1。通过Venny 2.1将94 个紫苏药物靶点和15 138 个CVD 靶点交集后获得药物-疾病共同靶点89 个。

图1 紫苏活性成分靶点与CVD 靶点交集

2.4 PPI 网络构建见图2～3。将89 个共同靶点提交至STRING 平台，研究物种设置为“Homo sapiens”，分析获得初步网络后，再获取相互作用的网络关系的靶点数据，将其导入Cytoscape 软件，绘制PPI 网络图，该网络图包含节点86个，边848 条。获得PPI 网络图后，利用Cytoscape 软件中cytoHubba 插件获得degree 排名前10 的关键靶点，分别为CASP3、CTNNB1、MYC、ALB、HIF1A、CCND1、FOS、VEGFA、CASP8、MDM2。上述靶点在PPI 网络图中发挥了重要作用，可能为紫苏与CVD 关联的关键靶点。

图2 靶点蛋白相互作用网络图

图3 PPI 网络中的高密度子网

2.5 “成分-靶点-通路-疾病”网络图见图4。以上述得到的41 个紫苏活性成分、246 靶点、30 条关键通路和CVD 为基础构建“Node”与“Style”文件，导入到Cytoscape 构建“成分-靶点-通路-疾病”网络。利用插件Network Analyzer 分析网络的拓扑参数，共166 节点，659 条边，平均节点度为7.94。由图可知一个活性成分和多个靶点及通路相连，一个靶点连接多个活性成分和靶点，这说明紫苏治疗CVD可能是多成分、多靶点、多通路的作用结果。化学成分木犀草素、芹菜素、β-胡萝卜素和β-谷甾醇连接度最高，鉴定为主要活性成分；与活性化合物连接度最高的靶点有CASP3、CTNNB1 等靶点，鉴定为关键作用靶点；与关键靶点连接度最高的有Pathways in cancer（P1）、Prostate cancer（P2）等，鉴定为重要生物学通路。

图4 紫苏治疗CVD 的成分-靶点-通路-疾病网络

2.6 GO 功能富集分析见图5～7。将89 个共同靶点导入STRING 数据库并导出GO 功能富集数据，进行分子功能（MF）、生物过程（BP）和细胞组分（CC）分析，筛选P-value 值前10 条利用微生信平台绘制气泡图。GO 富集分析结果显示，紫苏治疗CVD 共涉及85 个与MF 相关过程，富集度排前10 主要集中于结合、蛋白质结合等方面；936 条BP 通路，排在前10 其中主要生物过程有化学反应、有机物反应等；共有59 条CC 过程，富集度前10 主要涉及蛋白质复合物、细胞内细胞器腔等。

图5 GO 分子功能（MF）富集分析

图6 GO 生物过程（BP）富集分析

图7 GO 细胞组成（CC）富集分析

2.7 KEGG 富集分析见图8。主要有Pathways in cancer、Prostate cancer 等。通过KEGG 通路富集分析条形图直观地展现了每条信号通路中紫苏抗CVD靶点的富集比，图中纵坐标表示富集通路的名称，横坐标表示富集的基因数目。

图8 KEGG 通路富集分析

2.8 分子对接见表2、图9。从PubChem 数据库中下载木犀草素、芹黄素、β-胡萝卜素和β-谷甾醇的2D 结构。从PDB 数据库中下载CCND1、CASP3、CTNNB1、MYC、HIF1A、VEGFA、FOS、MDM2 和CASP8 蛋白的PDB 文件，处理后用AutoDock Vina 进行分子对接。能量越低，配体与受体结合的构象越稳定，发生作用的可能性越大。当结合能绝对值＞4.25 表示分子与靶点具有一定的结合能力，绝对值＞5.0 表示结合能力较强，绝对值＞7.0 表示结合能力很强[21]。

图9 紫苏活性成分与关键靶点对接

表2 紫苏活性成分与关键靶点的最低结合能

分子对接的最低结合能结果显示，CCND1、MDM2 与芹黄素、木犀草素有很强的结合活性；CASP3 与芹黄素、木犀草素、β-胡萝卜素有较强的结合活性，与β-谷甾醇有一定的结合活性；VEGFA与芹黄素、木犀草素有较强的结合活性；CASP8 与β-胡萝卜素、β-谷甾醇有较强的结合活性；HIF1A、FOS 与芹黄素有很强的结合活性；CTNNB1与β-胡萝卜素有较强的结合活性；MYC 与β-胡萝卜素有很强的结合活性。

3 讨论

CVD 已成为全球范围内发病率和致死率最高的疾病之一，全球约有1/3 的人死于CVD[22]。国内外研究表明，中医药可以从患者的具体病症出发，保护靶器官，预防多种并发症，能很好地预防CVD 的一级、二级、三级病症，所以中医在防治CVD 方面有独特的优势，体现了“治未病”的特色[23]。

本研究筛选得到紫苏治疗CVD 的活性成分4个，分别为β-谷甾醇、木犀草素、β-胡萝卜素和芹黄素。关键作用靶点为CCND1、CASP3、CCNNB1、MDM2、VEGFA、HIF1A、MYC、FOS 和CASP8。重要生物学路径为Pathways in cancer、PI3K-Akt、Kaposi′s sarcoma-associated herpes virus infection、Prostate cancer。核心作用网络如图10 所示，紫苏治疗CVD 具有多成分-多靶点-多通路的特点，4 个主要活性成分作用于9 个关键靶点通过4 条重要生物学路径发挥治疗作用。其中4 个主要成分的结构式如图11 所示。

图10 紫苏治疗CVD 的核心网络

图11 紫苏的主要活性成分

芹黄素是一种黄酮类化合物，别名洋芹素、芹菜素。国内外研究证明，芹黄素有很多生物活性，可以抗肿瘤、保护心脑血管等。芹黄素通过抑制血小板花生四烯酸代谢的途径来改善动脉粥样硬化和血栓的形成[24]。β-胡萝卜素也称叶红素，属于类胡萝卜素，可以抗氧化、抗癌和预防CVD，因此在食品生产中常用作添加剂[25]。木犀草素是黄酮类化合物，具有多种药理活性，可以消炎、降尿酸等，临床上用于治疗CVD[26]。β-谷甾醇具有祛痰、抑制肿瘤等作用，用于慢性气管炎、动脉粥样硬化症[27]等。这4 种活性成分对治疗CVD 都有一定的疗效，紫苏可能通过以上4 种成分防治CVD，说明本研究的预测结果有一定的可行性。

CASP3 即胱天蛋白酶3，可以发起细胞内源性凋亡信号，与CVD 的发生有着密切的关系。细胞周期蛋白1（CCND1），可以调控细胞周期的进程，促进细胞分裂。VEGFA 由多种细胞分泌，被认为是一种重要的内皮生长因子以及血管通透性的调节因子。CTNNB1、MYC、FOS、CASP8 都属于原癌基因。本研究表明紫苏药物可能作用于这些靶点调控CVD。

PI3K-Akt 信号通路与细胞内磷脂酰肌醇有关，关系着细胞的分化、增殖和凋亡。Pathways in cancer、Prostate cancer 等都和CVD 有着一定的关系，不好的饮食习惯会刺激FOS、CASP8 等原癌基因的表达，诱发癌症。研究表明，CVD 和癌症有着密切的关系，二者会相互促进加重[28]，因此这些通路是主要的信号通路。

本研究通过网络药理学初步揭示了紫苏在预防和治疗CVD 方面具有多成分、多靶点、多通路的协同作用特点。不仅为紫苏的临床应用提供了理论依据，为将来相关研究提供了基础，而且为传统中药材作用机制的研究提供新的思路。