蠲痹颗粒醇提物抑制Th17细胞表达治疗类风湿关节炎作用机制研究

吴招，邹楠婷，顾茜兰，杨海浩，应赛，李小丝，祁燕，彭江云，万春平

云南中医药大学，云南 昆明650500

类风湿关节炎（RA）是临床常见的慢性、全身性、自身免疫性疾病，病理表现为关节部位产生软骨侵蚀、淋巴细胞浸润、滑膜组织增生等而导致软骨和骨的破坏，引起关节畸形[1]。目前治疗RA 的现代医学药物主要有抗风湿药、非甾体类抗炎药、糖皮质激素、免疫抑制剂等，也采用基因治疗和免疫治疗[2]。温阳散寒除湿方（蠲痹颗粒）是云南省名老中医吴生元教授根据扶阳理论，针对RA 的临床治疗总结出的效验方，主要由川芎、附子、五加皮、桂枝等组成，具有祛风除湿、温经散寒、通络止痛的作用，主要治疗寒湿痹阻型RA。前期临床研究证实，蠲痹颗粒（JBKL）能改善寒湿痹阻型RA 患者临床症状，降低红细胞沉降率（ESR）、C-反应蛋白（CRP）、类风湿因子（RF）等指标，具有良好的临床疗效；此外，前期实验研究结果亦表明，蠲痹颗粒具有较好的镇痛作用和抗炎作用[3-4]。

Th17 细胞是一类与白细胞介素-23（IL-23）密切相关的Th 细胞亚群，其主要分泌IL-21，IL-17F，IL-17A 等。Th17 细胞主要介导机体自身免疫性反应、炎性反应等的发生与发展，具有高致病性[5]。前期研究结果显示，RA 患者体内的Th17 阳性细胞数量增加，与RA 的发展密切相关[6-7]。因此，本研究以Th17 细胞分化为切入点，研究蠲痹颗粒醇提物通过调控Th17 细胞而介导治疗RA 的作用机制，揭示蠲痹颗粒醇提物治疗寒湿痹阻型RA 的内在规律及临床应用的现代生物学特征。

1 材料与方法

1.1 动物7～8 周龄SPF 级雄性DBA/1 小鼠，体质量（20.00±2.00）g，购买于斯贝福（北京）生物技术有限公司[SCXK（京）2019-0010]。动物饲养于SPF 级动物房，饲料和水消毒后由动物自由摄取，环境温度（20±2）℃，相对湿度（50±5）%，12 h 昼夜循环，适应性饲养7 d。所有实验过程均遵循实验动物有关条例进行。

1.2 蠲痹颗粒浸膏醇提物的制备称取289.4 g 蠲痹颗粒，加水溶解混匀后加入乙醇，使含醇量达到80%，静置过滤，减压回收乙醇，得浸膏。将浸膏放入真空干燥箱干燥2 d后，获固体浸膏，得蠲痹颗粒浸膏醇提物3.658 g。蠲痹颗粒醇提物保存于4 ℃冰箱备用。

1.3 试剂及主要仪器牛Ⅱ型胶原、弗氏完全佐剂（CFA）（Sigma公司）；APC-小 鼠IL-17A 抗体（TC11-18H10）、FITC-小鼠IFN-γ 抗体（XMG1.2）、PE-Cy7 小鼠CD4 抗体（RM4.5）、PE-小鼠Foxp3（MF23）抗体（BD PharMingen 公司）；RPMI-1640 培养基（GibcoBRL 公司）；其他试剂均为分析纯。流式细胞仪（美国BD Biosciences）、离心机（德国Thermo Scientific Heraeus）、石蜡切片机（德国莱卡仪器有限公司）、二氧化碳培养箱（美国Thermo-fisher）；组织包埋机、烘片机、正置显微镜、全自动组织脱水机（德国莱卡仪器有限公司）。

1.4 关节炎模型的建立、分组及给药参照文献[8]构建DBA/1 小鼠关节炎（CIA）模型，具体方法为：牛Ⅱ型胶原加入醋酸，使牛Ⅱ型胶原与等体积的弗氏完全佐剂（CFA）充分乳化，DBA/1 小鼠麻醉后，对其尾根部致敏。1 周后以相同剂量进行第2 次免疫攻击，进行第2 次免疫攻击时，肉眼观察小鼠四肢关节炎严重程度，并进行评分，评分等级和标准为：1 级为正常、2 级为出现趾关节发红或红肿、3 级为踝关节以下中度红肿、4 级为包括膝关节在内的严重红肿、包括膝关节在内的完全红肿，关节变形、残废[9]。评分大于或等于2 级时说明小鼠造模成功。模型小鼠分为CIA 模型组（Model 组）和蠲痹颗粒醇提物干预组（JBKL 组），每组10 只。JBKL 组灌胃给予蠲痹颗粒醇提物21 mg/kg（相当于生药1.66 g/kg），Model 组给予相同剂量的0.9%氯化钠溶液作为对照。给药剂量按照实验动物与人用药量的换算公式计算得出。每天给药1 次。

1.5 细胞制备免疫20 d后，处死小鼠，消毒后取出脾脏和淋巴结。用载玻片磨碎脾脏和淋巴结，培养基冲洗过膜，离心后弃去上清，弹匀，加入红细胞裂解液，混匀，静置后加入培养基，离心后弃去上清。再加入培养基，过膜，离心。培养基冼2 次后，加入含血清的RPMI-1640，进行细胞计数，并将细胞调至所需浓度。

1.6 组织病理学检测小鼠处死后，取其后肢，福尔马林固定，脱钙后进行石蜡包埋，切片（5 μm 厚度），苏木精-伊红（HE）染色后显微镜下观察，按照关节组织学评分标准进行评定。见表1。

表1 关节组织学评分标准 分

1.7 流式细胞术检测胞内细胞因子染色：调至所需浓度的小鼠脾淋巴细胞与刺激剂于CO2培养箱中共培养4 h，收集培养后的细胞，洗液清冼2次，加入相应抗体并进行表面染色。染色结束后，进行固定和穿膜，加入荧光标记的抗IL-17 抗体，流式细胞仪检测分析。对于Treg 胞内荧光染色，按胞内染色方法染色，无需加入刺激剂，流式细胞仪收集细胞并进行分析。

1.8 荧光定量PCR 检测Th17 细胞相关基因的表达抽提小鼠脾淋巴细胞，提取总RNA后，操作合成cDNA。然后应用SYBR GreenI 嵌合荧光法在实时定量PCR 仪进行Th17 细胞相关基因（IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-23p19、IFN-γ 和RORγt）表达检测。PCR反应程序结束后，设置β-actin 为内参基因，计算出2 组基因表达差异倍数及标准差，即2-△△Ct±标准差值。目的基因特异性引物序列见表2。

表2 目的基因特异性引物序列

1.9 统计学方法运用GraphPad Prism、SPSS20.0软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对t检验；计数资料以百分比（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 蠲痹颗粒醇提物对CIA 模型小鼠关节炎组织病理的影响见图1。在CIA 模型组小鼠中观察到明显的关节炎病理表现：产生滑膜组织增生、淋巴细胞浸润、软骨和骨的侵蚀等，见图1A；而与Model 组比较，JBKL 组小鼠关节滑膜炎和关节损伤明显减轻，见图1B。与Model 组比较，JBKL 组关节组织学评分降低（P＜0.05），见图1C。

图1 蠲痹颗粒醇提物对CIA 模型小鼠关节炎组织病理的影响

2.2 蠲痹颗粒醇提物对CIA 模型小鼠调节性T 细胞的影响见图2。与Model 组比较，JBKL 组Foxp3+CD4+T（调节性T 细胞）表达水平上调（P＜0.05）。

图2 蠲痹颗粒醇提物对CIA 模型小鼠调节性T 细胞的影响

2.3 蠲痹颗粒醇提物对CIA 模型小鼠脾淋巴细胞Th17 表达的影响见图3。与Model 组比较，JBKL组小鼠脾淋巴细胞IL-17+CD4+比例降低（P＜0.05），Treg/Th17 比值增加（P＜0.05）。

图3 蠲痹颗粒醇提物对CIA 模型小鼠脾淋巴细胞Th17 表达的影响

2.4 蠲痹颗粒醇提物对CIA 模型小鼠Th17 相关基因表达的影响见图4。JBKL 组小鼠脾淋巴细胞IL-17A、IL-23p19、IL-21、IFN-γ 的mRNA 的表达水平低于Model组，Th17 特异转录因子RORγt 的转录水平低于Model 组（P＜0.05）。

图4 蠲痹颗粒醇提物对CIA 模型小鼠Th17 细胞相关基因表达的影响

3 讨论

RA 是主要以关节破坏性、关节侵蚀性及关节滑膜炎为病变特征的全身性自身免疫性疾病，临床表现为侵蚀性、对称性多关节炎性病变。伴随着疾病的发展，不仅影响患者的心脏、肾脏、肺部等器官，且对患者造成心理压力和经济负担[10]。疾病的发生主要与机体内T 细胞反应有关[11-12]。T 淋巴细胞主要分化为以Treg、Th17 为代表的两个细胞亚群。最新研究表明，Treg、Th17 细胞的功能和分化过程具有相同之处，两者却又相互对抗。Treg 细胞主要分泌抑炎细胞因子，对于RA 的发病起免疫抑制作用；Th17 细胞主要分泌促炎细胞因子，对于RA 的发病起促炎作用。Treg 细胞/Th17 细胞比例之间的平衡与失调影响着RA 病情的转移和发展[13-15]。本实验结果显示，蠲痹颗粒醇提物能够改善CIA 模型小鼠关节炎病理表现。流式细胞术检测结果表明，蠲痹颗粒醇提物干预后能下调Th17 细胞表达，上调Treg 细胞表达水平，即维持着Treg 细胞/Th17 细胞之间的平衡，下调促炎细胞因子白细胞介素IL-17A 表达，与前期研究结果一致[16]。

在Th17 的产生和分化过程中转录因子RORγt 起重要调控作用[17-18]。基于此，本研究进一步应用实时荧光定量PCR 深入研究蠲痹颗粒醇提物调控Th17 细胞分化的分子机制。实时荧光定量PCR 结果显示，蠲痹颗粒醇提物药物干预后显著下调Th17 相关基因IL-17A、IL-23p19、IL-21、IFN-γ及转录因子RORγt mRNA 表达水平。综合上述研究结果推测，蠲痹颗粒醇提物可能通过干预Th17 分化所需的关键细胞因子及转录因子的表达，阻止了CD4+T 细胞向高致病性Th17 细胞分化，维持Treg 细胞/Th17 细胞比例之间平衡，从而介导对RA 的治疗作用。

本研究不仅为扶阳学派吴生元教授运用扶阳理论治疗RA 提供一定的临床科学基础，同时也发展并丰富了中医治疗痹证理论的科学内涵。