血管生成素1通过ErbB1信号通路调节c-Abl介导大鼠慢性术后痛*

潘 鹏 张代玲 俞 灵 袁林芳 赵 赢 陆培春

江苏省昆山市中医医院麻醉科 215300

慢性术后痛(Chronic postsurgical pain,CPSP)的预后与血管生成密切相关,血管生成素-1(Angiopoietin-1,Ang-1)具有血管生成特性,主要与酪氨酸激酶受体结合后激活多种细胞内信号通路发挥作用[1],目前Ang-1参与CPSP的机制尚不明确。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor-1,ErbB-1)与炎症介质等结合即可启动细胞核内的相关基因,从而发挥促血管生成等作用[2],目前尚未见ErbB参与CPSP的相关报道。近年来,人们逐渐认识到炎症参与CPSP的发生,非受体酪氨酸激酶(c-Abl)参与细胞分化、细胞粘连等过程,据报道,在炎性疼痛模型中,炎症和氧化应激与c-Abl的过度表达有关[3],但在CPSP这一慢性炎症过程中c-Abl的表达尚且未知。本研究拟检测Ang-1、ErbB1、c-Abl 的定位及表达,进一步探讨CPSP发生的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由南通大学实验动物中心提供,伦理委员会批准(20170305-001),体重200～250g,鼠龄8～10周。随机将60只大鼠分成对照组、假手术组和模型组,每组20只。

1.2 大鼠皮肤/肌肉切口牵拉(Skin/muscle incision and retraction,SMIR)模型的制备 按照Flatters[4]的方法建立大鼠SMIR模型,对照组：不做任何处理;假手术组：麻醉后,无菌条件下在右后肢隐静脉内侧3～4mm处,切割皮肤1.5～2cm后缝合;模型组：在假手术组基础上暴露浅层肌肉,避开隐神经,将撑开器头部放入浅层肌肉下撑开至2cm,暴露内收肌筋膜,持续1h后缝合(见图1)。

图1 大鼠SMIR模型

1.3 机械性刺激缩爪阈值(Mechanical withdrawal threshold,MWT)检测 按照Dixon[5]方法测定MWT,von Frey filament纤毛刺激仪(美国North Coast Medical公司)按照刚度力的递增顺序(0.16～26g)垂直刺激术侧后爪的足底中部区域,以von Frey轻微弯曲并保持6～8s作为标准,出现缩爪、舔爪及爪子急剧撤回等现象视为阳性反应,否则为阴性。从0.16g开始,升降法记录5次,有2次或2次以上的反应视为机械性触诱发痛。若无则用相邻的大一级力度刺激,如出现2次及以上的阳性反应则给予相邻小一级力度的刺激,再连续测定5次,间隔30s。对照阈值表查阈值,单位为“g”。

1.4 转录组学测序 选取假手术组和模型组术后第7天L3～5脊髓腰膨大组织进行cDNA文库的制备和RNA测序,由上海中科新生命生物科技有限公司使用Illumina Novaseq 6000/MGISEQ-T7的高通量测序平台完成。对原始数据通过 perl 脚本进行处理,获得clean reads。使用HISAT2软件将clean reads与参考基因组进行比对,获得mapped reads。使用 Stringtie 软件对 mapped reads处理,然后使用 Gffcompare 软件与参考基因组 GTF/GFF 文件进行比较,发现新基因。FeatureCounts计算每个基因的read数,计算FPKM值。使用DESeq2进行差异表达分析,默认筛选阈值为：|log2FC|>1和P<0.05。使用 clusterProfiler R 软件包进行GO功能富集和 KEGG通路富集分析,当P<0.05 时,认为此GO或者KEGG功能存在显著富集情况。利用STRING数据库获得与基因相对应的蛋白质之间的相互作用关系。

1.5 蛋白质印迹检测Ang-1、ErbB1、c-Abl蛋白的表达 麻醉后收集术后第7天L3～5腰膨大,全细胞裂解试剂盒(上海生工公司)用于组织样品蛋白提取。将30μg 总蛋白加载到10%凝胶泳道上(上海生工公司)进行分离。然后使用转移系统(美国伯乐公司)将分离的蛋白转移到0.45mm PVDF膜上。在室温下将膜放在含有5.0% 脱脂奶粉的 Tris 缓冲盐水和Tween-20封闭溶液中孵育2h,然后在一抗封闭溶液中4.0℃下孵育过夜：Ang-1 (1∶1 000,英国abcam公司)、ErbB1(1∶1 000,美国CST公司)、c-Abl(1∶1 000,英国abcam公司)和GAPDH(1∶5 000,美国Sigma公司)。用Tris缓冲盐水和 Tween 20(10min/次)洗膜3次,室温下用羊抗兔二抗(1∶5 000,美国Jackson公司)孵育2h。洗涤后,使用Tanon 2500凝胶成像系统和超敏ECL化学发光检测试剂盒(爱必信生物科技公司)检测。使用 Image J分析结果,GAPDH作为内参。

1.6 免疫荧光染色 选取模型组术后第7天大鼠麻醉后,收集L3～5腰膨大,4%多聚甲醛固定,脱水。切成6μm的厚度切片。室温下用PBS洗涤,5%血清封闭2h,用1%血清稀释一抗。切片与 Ang-1(1∶100,英国abcam公司)、ErbB1(1∶100,美国CST公司)、c-Abl(1∶100,英国abcam公司)、NeuN(1∶100,美国CST公司)、GFAP(1∶100,美国CST公司)和Iba1(1∶100,英国abcam公司)孵育。4℃过夜,用PBS洗涤10min×3次。用PBS稀释二抗：Cy3-山羊抗兔IgG(1∶1 000,美国Jackson公司) 和FITC-山羊抗小鼠IgG (1∶1 000,美国Jackson公司)。室温下避光孵育2h,PBS冲洗15min×3次,封片。荧光显微镜进行拍照。

1.7 统计学方法 采用SPSS22.0软件分析实验数据,数据以mean±SEM表示。行为学数据采用双因素重复测量方差分析,事后检验采用Bonferroni多重比较分析。Image J软件分析蛋白质印迹特异性条带密度以及免疫荧光强度值,多组间比较采用单因素方差分析;两组间比较采用Student’st-test。P<0.05为差异有统计学意义。所有实验至少重复3次。

2 结果

2.1 SMIR 后不同时间点MWT 对照组、假手术组和模型组术前MWT基础值分别为(23.42±1.12)g、(23.16±1.14)g和(22.76±0.87)g,组间无统计学差异(P>0.05)。与基础值比较,模型组在术后第1、3、7、14天呈进行性下降;与对照组和假手术组比较,模型组显著降低。见图2。

图2 SMIR后不同时间点MWT与对照组比较,*P<0.05;与假手术组比较,#P<0.05

2.2 转录组学测序 转录组测序筛选差异表达基因(见图3),对差异表达基因进行KEGG信号通路富集分析(见图4、图5),发现Ang-1、ErbB1、c-Abl以及ErbB信号通路差异表达。对差异表达基因进行PPI分析(见图6),发现Ang-1、ErbB1、c-Abl存在关联。

图3 差异基因筛选火山图

图4 KEGG信号通路富集分析

图5 ErbB信号通路图

图6 PPI网络图

2.3 蛋白质印迹检测大鼠脊髓中Ang-1、ErbB1、c-Abl蛋白的表达 运用蛋白质印迹分析Ang-1、ErbB1、c-Abl蛋白在脊髄中表达。模型组术后7d脊髄中Ang-1表达降低(见图7a),ErbB1、c-Abl表达增加(见图7b～c)。

图7 大鼠脊髓中Ang-1、ErbB1、c-Abl 蛋白表达变化与对照组比较,*P<0.05;与假手术组比较,#P<0.05

2.4 免疫荧光检测Ang-1、ErbB1和c-Abl在大鼠脊髓中定位 为研究Ang-1、ErbB1和c-Abl在大鼠脊髓中具体表达于哪些细胞中,选取模型组术后第7天的脊髓组织切片,将Ang-1、ErbB1和c-Abl分别与脊髓中各类细胞标记物进行免疫荧光双标。结果显示：Ang-1与NeuN和Iba1共定位,与GFAP不定位(见图8)。ErbB1与NeuN、GFAP共定位,与Iba1不共定位(见图9)。c-Abl与NeuN不共定位,与GFAP、Iba1共定位(见图10)。

图8 Ang-1在脊髓中的定位(×200,标尺50μm)

图9 ErbB1在脊髓组织中的定位(×200,标尺50μm)

3 讨论

疼痛可能由不同的原因引起,如急性伤害性刺激、炎症、神经损伤或癌症,慢性疼痛更是会持续几周、几个月或几年。细胞因子、趋化因子和前列腺素等从脊髓背角激活的小胶质细胞 (Microglia,MG)和星形胶质细胞(Astrocyte,AS)释放出来发挥重要作用[6]。SMIR模型长时间牵拉皮肤、肌肉组织,能较好地反映术后持续性疼痛过程,模型组术后 MWT 呈时间依赖性显著下降,术后第7天下降最明显,表明本实验成功复制了该模型。

在脊髓损伤后Ang-1通过Tie2受体促进内皮细胞存活,稳定血管,减少白细胞浸润,减轻炎症并改善中枢神经系统微环境,阻断 Tie-2 激活加剧了血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)破坏[7]。本实验选取模型组MWT 最低的术后第7天为观察点,发现模型组机械性痛觉超敏,转录组测序发现Ang-1表达降低,蛋白质印迹检测Ang-1蛋白表达降低,表明Ang-1表达下调,可能与BBB通透性增加,炎性介质渗出有关,在CPSP发生过程中发挥重要作用,这与Meng等人[8]证明 Ang-1 过表达减少了BBB泄漏,抑制 BBB 损伤结果一致。在蛛网膜下腔出血大鼠中,给予外源性 Ang-1 可减少 BBB 渗漏[9],这些表明 Ang-1对 BBB 损伤具有保护作用。

Ang-1对体外培养的神经元具有抗凋亡和神经营养作用,发挥着促进神经修复再生的作用,在神经系统中Ang-1 抑制MG的活化,具有保护作用[10]。本课题对大鼠脊髓切片进行免疫荧光染色发现 Ang-1与NeuN共标,与GFAP不共标,与Iba1共标,为Ang-1参与CPSP提供分子生物学基础。相关研究表明高表达的Ang-1可减轻慢性痛患者痛苦,抑制嗜中性粒细胞弹性蛋白酶可有效缓解脊髓损伤大鼠脊髓中Ang-1的下降,同时缓解由于损伤引起的疼痛[11],表明Ang-1可通过促进小胶质细胞的激活参与CPSP的发生发展。

Ang-1和ErbB激酶,特别是ErbB1,对于γ-氨基丁酸(GABA)至关重要,包括神经元间迁移,轴突和树突的发育以及突触的形成。ErbB家族包括四个成员：ErbB1、ErbB2、ErbB3和ErbB4,ErbB1被激活与酪氨酸激酶有关,它可以在神经炎症过程中被炎症介质、趋化因子和细胞因子的信号激活,ErbB1抑制剂可以显著减少炎症和小鼠慢性疼痛[12]。本实验通过转录组测序发现ErbB1表达升高,蛋白质印迹检测ErbB1蛋白表达升高,通过KEGG信号通路显著性富集分析发现ErbB信号通路,表明ErbB1 和ErbB 信号通路与 CPSP 的发生有关。这与Verma V等人[13]研究的分子遗传学分析支持ErbB1参与慢性疼痛结果相一致。

据报道,在脊髓中ErbB1优先在胶质细胞中的表达[14]。已有研究发现,在小鼠炎症性疼痛模型的 DRG中磷酸化的ErbB1被瞬时激活[12]。本课题对大鼠脊髓切片进行免疫荧光染色发现ErbB1与NeuN、GFAP共标,与Iba1不共标,研究结果为ErbB1及ErbB信号通路参与CPSP提供支持。

脊髓中小胶质细胞激活通过 IL-1 信号传导增加神经元活动来触发慢性疼痛。Ang-1持续激活巨噬细胞ErbB1受体,抑制PI3K/Akt和STAT3信号通路,减少炎性细胞因子的释放。本课题研究发现c-Abl与小胶质细胞共定位,KEGG信号通路显著性富集分析和PPI分析发现Ang-1通过ErbB信号通路调节c-Abl,表明Ang-1可通过ErbB1调控c-Abl,激活小胶质细胞,参与CPSP。

先前的研究表明,在炎性疼痛模型中观察到c-Abl的表达增加,c-Abl抑制剂降低了胶质细胞的激活和疼痛的过敏性,炎症和氧化应激与c-Abl的过度表达和激活有关[3]。本课题通过转录组测序发现c-Abl mRNA表达升高,蛋白质印迹检测c-Abl蛋白表达升高,表明c-Abl的表达上调促进了经典的小胶质细胞的促炎激活,通过调节小胶质细胞活化和神经炎症参与了慢性疼痛的发病过程。本课题不足之处未对Ang-1、ErbB1和c-Abl进行过表达和小干扰处理,仍需进一步深入研究CPSP的具体机制。

综上所述,Ang-1、ErbB1和c-Abl参与了CPSP发生发展,Ang-1通过ErbB信号通路调节c-Abl在CPSP中发挥重要作用,为CPSP治疗提供理论基础。