石菖蒲中α-细辛脑含量测定方法建立及其在开心散中量值传递研究

高文雅 ，冯敏 ，高畅 ，赵海誉 ，周严严 ，王宏洁 ，张丽丽 ，高彦青 ，肖艳红 ，程翠娜 ，魏晓露 ，边宝林 ，司南

1.中国中医科学院中药研究所，北京 100700； 2.葵花药业集团（唐山）生物制药有限公司，河北 唐山 064400

石菖蒲为天南星科菖蒲属植物石菖蒲Acortw tatarinowiiSchot的干燥根茎，具有开窍豁痰、醒神益智、化湿开胃功效[1]。挥发油是石菖蒲的主要有效成分，是石菖蒲质量评价的重要指标[2]。开心散始载于《备急千金要方》，由远志、人参、茯苓、石菖蒲组成，有安神、补气、利湿化浊功效，目前临床常用于阿尔茨海默病、血管性痴呆等以记忆功能障碍为主要表现的疾病[3]。石菖蒲作为开心散的主要成分，占处方药量的32.5%。α-细辛脑是石菖蒲的主要挥发油成分，具有利胆、降血脂、解痉平喘、止咳祛痰等作用[4]。研究发现，α-细辛脑能显著改善帕金森模型小鼠[5]及痴呆模型小鼠[6]的行为缺陷[7-8]。控制α-细辛脑含量对石菖蒲药材、饮片及其相关制剂均有重要作用。2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）仅用挥发油含量控制石菖蒲的质量，未对其中的有效成分进行精准的控制。本研究运用HPLC建立石菖蒲药材、饮片及经典名方开心散中α-细辛脑的含量测定方法，对15批不同产地石菖蒲药材、饮片及开心散样品进行检测，同时考察α-细辛脑在药材→饮片→开心散样品间的量值传递关系，进一步完善复方制剂开心散的质量控制标准。

1 仪器与试药

LC-2030C 3D型高效液相色谱仪，日本岛津公司；KQ-250B型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；CP423C型电子天平，奥斯豪仪器（上海）有限公司；XA105型十万分之一、ML-104T/02型万分之一分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

α-细辛脑对照品（批号100298-201203，纯度99%，中国食品药品检定研究院）。色谱级乙腈、甲醇，质谱级甲酸，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；娃哈哈纯净水。人参、远志、茯苓、石菖蒲药材及饮片，葵花药业集团（唐山）生物制药有限公司提供，经中国中医科学院中药研究所何希荣主管药师鉴定，分别为五加科植物人参Panax ginsengC. A. Mey.的干燥根和根茎、远志科植物远志Polygala tenuifoliaWilld.的干燥根、多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核、天南星科植物石菖蒲Acorus tatarinowiiSchott的干燥根茎，符合2020年版《中国药典》（一部）规定。15批石菖蒲药材及饮片产地信息见表1。

表1 15批石菖蒲药材及饮片产地信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

YMC Hydrosphere C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（44∶56），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长325 nm。

2.2 溶液制备

2.2.1 开心散样品人参、远志、石菖蒲和茯苓分别粉碎过筛后，按1∶1∶25∶50比例混合均匀，即得。

2.2.2 对照品溶液

取α-细辛脑对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液。

2.2.3 石菖蒲药材及饮片供试品溶液

石菖蒲粉碎后过3号筛，精密称取石菖蒲粉末0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声（功率250 W，频率40 kHz）处理1 h，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.2.4 开心散供试品溶液

精密称取开心散粉末1.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，超声（功率250 W，频率 40 kHz）处理l h，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3 石菖蒲药材含量测定

2.3.1 空白试验

石菖蒲药材样品色谱图中的被测峰与对照品α-细辛脑的出峰时间及紫外图谱均相同，在此色谱条件下甲醇溶剂无干扰。

2.3.2 线性关系考察

取α-细辛脑对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含α-细辛脑0.197 mg的溶液。精密吸取1、2、4、6、8 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，每个浓度连续进样3次，测定峰面积，以对照品进样量（μg）为横坐标，对照品峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得α-细辛脑回归方程Y=2×107X-2 707.9，R²=1。结果表明，α-细辛脑在0.197～3.936 μg范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验

取石菖蒲药材（批号YFT003001810008），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，连续测定6次峰面积，结果RSD=0.2%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验

取石菖蒲药材（批号YFT003001810008）样品6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，测定峰面积，结果RSD=1.3%，表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验

取“2.3.4”项下供试品溶液，室温放置，分别于制备后0、4、6、13、28、47、69、105 h进样，测定峰面积。α-细辛脑峰面积RSD=0.7%，表明样品溶液中被测成分的含量至少在105 h内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验

称取已知含量的石菖蒲药材（ 批号YFT003001810008）样品0.25 g，共6份，精密称定。根据重复性试验结果，药材中被检测成分α-细辛脑含量0.2%，配制每毫升含α-细辛脑0.02 mg的甲醇溶液作为加样液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，进行测定。α-细辛脑平均回收率为96.2%，RSD=1.0%，回收率符合含量测定要求。

2.3.7 样品含量测定

按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件，测定15批石菖蒲药材样品中α-细辛脑含量。色谱图见图1。采用2020年版《中国药典》（四部）通则0832第四法（甲苯法）测定15批石菖蒲药材水分。干燥品中α-细辛脑含量=样品中α-细辛脑含量÷（1-水分%）。结果见表2。按干燥品计算，石菖蒲药材中α-细辛脑的含量高于0.03%。

图1 石菖蒲药材、饮片及开心散中α-细辛脑HPLC图

表2 15批石菖蒲药材α-细辛脑含量测定结果（%）

2.4 石菖蒲饮片含量测定

2.4.1 空白试验

同“2.3.1”项。

2.4.2 线性关系考察

同“2.3.2”项。

2.4.3 精密度试验

取石菖蒲饮片（批号YF181008Q），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，连续测定6次峰面积，结果RSD=0.5%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验

取石菖蒲饮片（批号YF181008Q）样品6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，测定峰面积，结果RSD=0.5%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 稳定性试验

取“2.4.4”项下重复性供试品，室温放置，分别于制备后0、4、6、13、28、47、69、105 h进样，测定峰面积。α-细辛脑峰面积RSD=0.6%，表明样品溶液中被测成分的含量至少在105 h内稳定性良好。

2.4.6 加样回收率试验

称取已知含量的石菖蒲饮片（批号YF181008Q）样品0.25 g，共6份，精密称定，配制每毫升含α-细辛脑0.02 mg的甲醇溶液作为加样液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液并测定。结果α-细辛脑平均回收率为97.4%，RSD=0.5%，符合含量测定的要求。

2.4.7 样品含量测定

按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件进样测定，计算α-细辛脑含量。按“2.3.7”项下方法测定15批石菖蒲饮片水分，并计算干燥品中α-细辛脑含量，结果见表3。按干燥品计算，石菖蒲饮片中α-细辛脑的含量高于0.02%。

表3 15批石菖蒲饮片α-细辛脑含量测定结果（%）

2.5 开心散样品含量测定

2.5.1 空白试验

开心散样品色谱图中的被测峰与对照品的出峰时间相同，且开心散样品色谱图中被测峰与对照品色谱峰紫外图谱相同。按“2.2.1”项下方法制备石菖蒲阴性制剂，并按“2.2.4”项下方法制成石菖蒲阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，发现该色谱条件下阴性对照无干扰。

2.5.2 线性关系考察

同“2.3.2”项。

2.5.3 精密度试验

取开心散样品（批号KXS-01），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件连续测定6次，结果峰面积RSD=0.3%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 重复性试验

取开心散样品（批号KXS-01）样品6份，制备供试品溶液，并按“2.1”项下条件测定，结果峰面积RSD=0.9%，表明该方法重复性良好。

2.5.5 稳定性试验

取“2.5.4”项下重复性供试品，室温放置，分别于0、4、6、13、28、47、69 h进样，按“2.1”项下条件测定峰面积，α-细辛脑峰面积RSD=0.5%，表明样品溶液中α-细辛脑在69 h内稳定性良好。

2.5.6 加样回收率试验

称取已知含量的开心散样品（批号KXS-01）样品0.75 g，共6份，精密称定。根据重复性试验结果，药材中被检测成分α-细辛脑含量0.205%，配制每毫升含α-细辛脑0.02 mg的甲醇溶液作为加样液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件测定。结果α-细辛脑的平均回收率为96.97%，RSD=1.2%，符合含量测定的要求。

2.5.7 样品含量测定

按上述方法测定15批开心散样品中α-细辛脑含量，按“2.3.7”项下方法测定样品中水分，并计算干燥品中α-细辛脑含量，结果见表4。按干燥品计算，开心散样品中含α-细辛脑不少于0.010%。

表4 15批开心散样品α-细辛脑含量测定结果（%）

2.6 混批药材-饮片-开心散样品含量对应关系

将15批远志、人参、茯苓、石菖蒲饮片分别进行混批后，测定混批药材和饮片的α-细辛脑含量。饮片粉末按样品制备方法制成开心散样品，平行配制3份，测定样品α-细辛脑含量，考察药材-饮片-样品间的质量传递关系，结果见表5。混批药材到饮片α-细辛脑的转移率为109.01%，饮片配制成样品后α-细辛脑的转移率为104.45%，均在70%～130%范围内。

表5 混批药材-饮片-开心散样品α-细辛脑质量传递结果

3 讨论

经前期试验发现，细辛脑类成分超声提取优于回流提取，以甲醇为溶剂提取效果较好。对不同加液倍数（25、50、125倍）和超声时间（30、45、60 min）进行比较，最终确定供试品提取方法为加50倍量甲醇超声提取60 min。

本试验考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸水不同流动相比例方法，分别尝试YMC Trait、YMC Hydrosphere、SilGreen C18色谱柱，对样品进行色谱条件的摸索。结果在柱温30 ℃、流动相为乙腈-水（44∶56）、流速1 mL/min条件下，各色谱柱均能相对较好地分离。α-细辛脑最大吸收波长257 nm，但是在该吸收波长下细辛脑类物质比较复杂，不易进行有效分离。经过6根不同厂家不同色谱柱的预试，与杂质峰的最大分离度仅为1.6左右，虽然符合《中国药典》规定，但系统适用性不佳。比较波长257、311、325 nm的含量测定结果发现，同一样品在不同吸光度下测定的含量基本相同，且波长325 nm处杂质峰无吸收。因此，α-细辛脑含量测定选用325 nm波长。

在15批药材-饮片质量传递研究过程中发现，理论认为药材经加工成饮片后，α-细辛脑由于具有挥发性，其含量不应高于原药材。而根据测定的结果，石菖蒲饮片中的α-细辛脑含量变化趋势不统一，其中4批不在70%～130%可接受范围内。进一步对液相图谱进行比较，以及对生产加工及检测流程进行深入思考，认为造成这种情况的原因比较复杂，排除药材-饮片之间是否严格遵守一一对应及不可避免的人为失误等，其原因可能有：①检测取样均匀性。在大宗药材中取少量进行测定，虽然进行了混合和重复，却仍存在一定随机性，尤其是根茎、枝状药材，更容易存在这样的问题。在20 kg药材中仅取出一部分（500 g）药材粉碎检测后，另取一部分（2 kg）做成饮片，所检测药材只能象征性代表大宗药材总体质量，制得的饮片也不能完全代表大宗药材，由于取样不均匀，造成药材→饮片成分传递间的不对应性。②饮片制备过程中的不稳定性。在饮片操作过程中，应严格控制相关参数，如润湿、干燥时间、温度等，以保证饮片质量。根据15批药材→饮片→样品间的质量传递结果，我们发现存在一部分逸出值，经过分析和讨论，认为由于取样不均匀造成此问题的可能性最大。因此进行混批后同时测定，研究其传递问题。排除该影响后，质量可以较好传递，无逸出。